【摘 要】
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目的:青光安颗粒剂对青光眼具有视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的保护作用,此作用是通过调控RGCs的线粒体自噬介导的,它保障了线粒体自噬途径的完整,将高眼压应激所产生的线粒体自噬向“有益的”方向调控,并予以增强。通过此项研究,为青光眼视神经保护探索一条线粒体自噬的研究途径,为青光安颗粒剂的神经保护效应提供理论支持。方法:取健康2-3月龄的SD大鼠60只,体
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目的:青光安颗粒剂对青光眼具有视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）的保护作用,此作用是通过调控RGCs的线粒体自噬介导的,它保障了线粒体自噬途径的完整,将高眼压应激所产生的线粒体自噬向“有益的”方向调控,并予以增强。通过此项研究,为青光眼视神经保护探索一条线粒体自噬的研究途径,为青光安颗粒剂的神经保护效应提供理论支持。方法:取健康2-3月龄的SD大鼠60只,体重0.2kg-0.4kg,将此分为A、B、C共3组,每组20只。其中:A组:正常组;B组:模型组;C组:模型+青光安治疗组。采用巩膜上静脉烧灼的方法建立慢性高眼压模型,A组常规饲养,B组每日以等量生理盐水灌胃,C组每日以等效计量青光安颗粒剂灌胃。术后测量各组眼压,每周测量一次,检测3个月。眼压用TONO-PEN手持式眼压计测量。给药方法:首先计算好成人等效剂量,将青光安颗粒剂溶解于生理盐水中。B组每日以等量生理盐水灌胃,每日一次;C组每日以青光安颗粒剂灌胃,每日一次。各组大鼠均以常规饲料喂养3个月。3个月后,各组大鼠取视神经进行流式检测线粒体的膜电位;取视网膜进行WB检测Bcl 2、LAMP1、parkin、optineurin蛋白的表达;进行荧光金标记检测。结果:1.模型组大鼠眼压水平升高（P＜0.05）;与模型组比较,模型+青光安治疗组眼压水平降低（P＜0.05）,说明青光安颗粒剂具有调节眼压的作用。2.免疫荧光金标记:与对照组正常大鼠视网膜FG逆行标记结果显示各象限染色均匀,RGCs以视盘为中心,放射状向外分布,越靠近视盘RGCs越密集,细胞多呈圆形、椭圆形或多角形,胞浆均匀明亮,边界清楚,胞外无荧光渗漏,少数细胞呈强荧光可见突起。模型组、模型+青光安治疗组与正常组相比,模型组、模型+青光安治疗组RGCs细胞明显减少,模型+青光安治疗组与模型组相比,模型+青光安治疗组RGCs细胞增加。模型+青光安治疗组的RGCs数量较模型组多,细胞的结构和形态较模型组稳定,表明青光安颗粒剂能有效的保护高眼压形态下的RGCs的数量及细胞结构和形态的稳定。3.流式检测:JC-1具有较好的灵敏性,可使用流式细胞仪或荧光分光光度计检测荧光值的变化。采用荧光显微镜或流式细胞仪对线粒体膜电位作定性和定量的分析。结果表明:与正常组相比,模型组、模型+青光安治疗组绿色荧光占比增加,细胞早期凋亡严重,线粒体膜电位下降显著（P＜0.05）。与模型组比较,模型+青光安治疗组细胞早期凋亡程度低于模型组。青光安有效的抑制了线粒体早期的凋亡。4.Western Blot检查:结果显示,模型组与正常组相比Bcl-2的表达减少,增加了细胞的凋亡;模型+青光安治疗组与模型组比较,Bcl-2的表达增多,增多的Bcl-2通过改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位从而减少了细胞凋亡。模型组与正常组相比Parkin的表达减少,减少了诱导线粒体自噬的发生;模型+青光安治疗组与模型组比较比较,Parkin的表达增多,活化的Parkin可对多种线粒体蛋白底物进行多聚泛素化修饰。在LC3接头蛋白的作用下,将自噬体靶向至线粒体,增加诱导线粒体自噬的发生。模型组与正常组相比LAMP-1、Optineurin的表达增加,造模后,大鼠眼压增高,诱导线粒体自噬;模型+青光安治疗组与模型组比较比较,LAMP-1、Optineurin的表达较少,表明青光安治疗后,RGCs的线粒体自噬增加,对高眼压下大鼠的RGCs起到保护作用。结论:青光安颗粒剂是青光眼视神经保护的有效药物,能有效降低青光眼大鼠的眼压;抑制RGCs早期的凋亡;在大鼠青光眼状态下,青光安能增强青光眼模型RGCs的线粒体自噬,对青光眼RGCs具有保护作用。
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