论文部分内容阅读
研究背景与目的地中海贫血（thalassemia简称地贫）是一组由于α/β珠蛋白基因簇缺失或者突变导致造血障碍从而引起小细胞低色素性的溶血性贫血。地中海贫血通常为常染色体隐性遗传病,男女双方均携带了同型珠蛋白（同为α或者同为β）基因的点突变或者缺失突变,则该夫妇对为高风险夫妇对,有可能生出Hb Bart’s水肿胎、Hb H病以及中间型或重型β地中海贫血患儿。目前地中海贫血的治疗是规律输血配合铁螯合剂进行去铁治疗,对家庭、对社会来说都是沉重的经济负担以及巨大的精神压力。针对地中海贫血而言,预防的重要性胜于治疗。开展人群普查以及遗传咨询,全面普及婚前以及产前检查,以预防Hb Bart’s水肿胎的发生以及中间型或重型β地中海贫血患儿的出生,是我国公共卫生的重要组成部分。根据最新的 HbVar 数据（http://globin.bx.psu.edu/cgi-bin/hbvar）,全世界已经发现超过500种与地贫相关的突变类型。其中中国人群中最常见的α缺失有（--SEA/）,此外还有（-α3.7/）、（-α4.2/）、（--THAI/）、（--FIL/）、（--11.1kb/）和（-α27.6kb/）等,最常见的α点突变有αQSα/、αCSα/、αWSα/,此外还有αCD31α和αCD78α/等。中国人群中已报道过的β地中海贫血点突变至少有54种,其中以下这八种突变大约占全部突变类型93%以上:HBB:c.126129delCTTT,HBB:c.52A>T,HBB:c.316-197C>T,HBB:c.-78A>G,HBB:c.216217insA,HBB:c.79G>A,HBB:c.92+1G>T和HBB:c.-79A>G,此外还有HBB:c.-123A>T、HBB:c.-140C>T和HBB:c.162delT等;中国人群中已报道过的缺失型β-地中海贫血有5种突变类型,包括Chinese缺失、东南亚型HPFH缺失、Taiwanese缺失、Gantonese 缺失和 Yunnanese 缺失。地中海贫血点突变的基因检测方法目前主要是PCR-RDB、Sanger测序、荧光PCR熔炼曲线法、HPLC、HRM和ARMS-PCR等,缺失型地中海贫血的突变检测方法主要有Southern blot、Gap-PCR、MLPA、荧光定量PCR和array-CGH等。它们或操作繁琐,或检测通量低,虽可以应用于常规临床检测,但不适用于大人群的基因筛查。近年热门的二代测序以其高准确性、高灵敏性以及高通量可以应用于大人群的基因筛查,但是费用昂贵,难以大范围推广应用。建立简单快捷、准确可靠、经济实用的高通量检测技术,既满足地中海贫血大规模人群筛查的公共卫生需要,也是目前地贫基因诊断技术创新的新挑战。本研究的目标即建立一种基于同一检测平台的地贫分子诊断新途径与新方法,准确可靠、简单实用、高通量、低成本,适合当前地贫大规模人群筛查和常规分子诊断。研究方法与内容根据地贫的发病机制及分子基础,针对中国人群中已报道（截止本研究启动时）的α/β地贫点突变以及缺失突变,本研究具体实施了以下研究方案。1.SNPscan的地中海贫血点突变检测技术--利用连接酶的高特异性识别SNP位点的等位基因,在连接探针末端加入长度不同的非特异性序列,然后通过连接酶的连接反应获得不同位点所对应的不同长度的连接产物,接着利用带有荧光标记的通用引物把连接产物作为模板再进行PCR反应,把连接产物扩增出出来,接下来进行毛细管电泳,使不同荧光标记的不同序列分离出来,最后对电泳图谱进行分析以达到对不同SNP位点的基因型分型的目的。2.CNVplex的地中海贫血缺失突变检测技术--利用连接酶的高特异性连接反应使目的片段通过杂交、连接,从而在连接探针末端引入长度不同的非特异性序列以及利用连接酶的特异性连接反应获得不同位点所对应的长度各异的连接产物,再通过带有不同标记荧光的通用引物通过PCR反应将连接产物进行扩增,然后把PCR产物上测序仪跑毛细管电泳从而把不同长度的片段分离出来,最后对毛细管电泳图谱进行分析读取各个位点的峰值,通过计算各个目标区峰相对参照峰的比值,算出待检区域的拷贝数。3.诊断方法初步评价。为当前地贫大规模人群筛查提供简单实用的分子诊断方法,是本研究的目标之一,为初步评价新诊断方法用于地贫人群筛查的实用性与可行性,本研究抽取100份婚前/产前检查标本,应用新诊断方法及gap-PCR、Sanger测序同时进行检测,对检测结果进行比较。4.诊断方法的大样本盲法分析评价。准备了 1747份表型资料齐全、已采用gap-PCR、RDB、Sanger测序等方法进行地贫分子诊断的待检样本,将这些样本进行盲法编号后,应用新诊断方法进行检测分析;然后对比分析相对应的基因检测结果,对于结果不相符的标本,再用gap-PCR或Sanger测序进行对比检测,以全面评价新诊断方法进行地贫分子诊断的灵敏度、准确性及实用性。研究结果根据研究目标,通过实施具体研究方案,所获得的研究结果如下:1.建立了稳定可靠的地中海贫血点突变检测技术--SNPscan。该体系基于ABI 3130xl PRISM的遗传分析系统,共分两个panel,panelA1可检测38个不同的地贫点突变位点,panelA2可检测29个不同的地贫点突变位点,经验证,其特异性可靠。2.建立了稳定可靠的地中海贫血缺失突变检测技术--CNVplex。该体系基于ABI 3130xl PRISM的遗传分析系统,通过对HBB、HBA1、HBA2的基因拷贝数检测进行缺失型地贫诊断,经验证,其特异性可靠。3.初步评价实验中,应用新方法和gap—PCR及Sanger测序法,同步检测100例婚检/产检gDNA标本,分别检出α地贫杂合子16例,β地贫杂合子5例,经对比分析,两方法的检测结果相符,且均为中国人群常见的变异基因型,新方法的准确性为100%。新技术简单易行、通量高,检测结果准确可靠,初步说明了新方法进行大规模人群筛查的可行性与实用性。4.诊断方法的大样本盲法分析评价:1747例样本的基因分析结果为正常对照样本100例;Hb H病样本636例,其中HbH病合并β地中海贫血杂合子样本31例;中间型/重型β地中海贫血样本1011例,其中中间型/重型β地中海贫血合并轻型/静止型α地中海贫血样本155例,中间型/重型β地中海贫血合并Hb H病5例。SNPscan及CNVplex检测方法检测结果与传统方法基因分型结果相符1737例,不相符10例。经进一步验证,不相符的10例样本检测结果与SNPscan及CNVplex检测结果一致。SNPscan及CNVplex检测方法进行地中海贫血点突变、缺失检测的准确率达到100%,SNPscan及CNVplex检测方法稳定、可靠。结论本研究建立了 SNPscan及CNVplex方法检测地中海贫血点突变、缺失或重复。SNPscan检测方法可检测α/β-地中海贫血67个点突变位点,CNVplex检测方法可检测缺失型α/β-地中海贫血。通过对特异性与准确性的全面评价,以及人群筛查的实用性初步评价,充分说明了本研究建立的分子诊断新方法准确可靠、简单实用、高通量、低成本,适合地贫的大规模人群筛查和常规诊断。SNPscan具有通量高、操作简单、准确率高、成本低、耗时短的优点,CNVplex具有通量高、操作简单、准确率高、成本低的优点,既适用于临床基因分型检测,更适用于大人群基因筛查。研究背景与目的α地中海贫血是α珠蛋白基因突变使α珠蛋白链的合成完全或部分抑制而引起的遗传性溶血性贫血,是我国南方最常见的单基因遗传病之一。该病主要是由于α珠蛋白基因的缺失引起,少部分是由于α珠蛋白基因点突变导致的。本研究结合血液学表型和珠蛋白基因型数据,对一例广东的重度贫血患儿实施准确诊断。研究方法与内容采集该患儿的家系成员的外周血,采用全自动三分类血液分析仪及HPLC血红蛋白分析系统进行红细胞参数和血红蛋白组分分析,采用传统的酚-氯仿法提取基因组DNA,采用Gap-PCR、反向点杂交及Sanger测序等方法分析家系成员的珠蛋白基因型。研究结果血液学表型数据显示该患儿表现为小细胞低色素的重度贫血（MCV60.6pg,MCH18.1fL,Hb50g/L）,血红蛋白组分分析发现异常血红蛋白H带阳性;患儿外婆表型无异常,患儿父母及舅舅均表现出小细胞低色素特征。基因分析发现患儿基因型为--SEA/ααCD29,其父亲基因型是--SEA/αα,其母亲及舅舅基因型均为ααCD29/αα。结论Hb Agrinio（HBA1:CD29T>C）为不稳定异常血红蛋白,血红蛋白组分检测为阴性,必须通过基因分析的方法才能诊断。该突变复合α0地贫表现为HbH病,且贫血程度偏重。