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成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)广泛分布于全身,其生物学效应是通过与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors, FGFRs)结合而实现。大量研究发现,FGFRs的基因突变可导致包括颅缝早闭、软骨发育不良在内的多种人类骨骼遗传疾病。颅缝早闭是指颅盖骨之间的联结,即颅缝在大脑发育成熟以前提前闭合的病理状态,常导致典型的颅面畸形和神经系统功能障碍。Apert综合征是一种常见的人类颅缝早闭综合征,以冠状缝早闭和手足的并指/趾畸形为典型体征。Apert综合征主要由两种Fgfr2功能获得性突变,即Fgfr2 Ser252Trp或者Pro253Arg突变引起。Fgfr2 S252W突变患者主要表现出严重的颅面部骨骼畸形,而Fgfr2 P253R突变患者的手足并指/趾畸形更为突出。2003年和2005年Chen和Wang分别独立报道了其建立的Fgfr2 S252W突变小鼠模型,Chen发现Fgfr2 S252W突变小鼠的骨组织发育异常,指出细胞凋亡增加可能是Apert综合征发生冠状缝早闭的机制。Wang描述了在Fgfr2 S252W突变小鼠颅骨发育中和长骨骨髓体外培养中出现的某些软骨组织异常,但是没有对其做更深入的探讨。目前,Fgfr2 P253R突变对成骨细胞、软骨细胞发育和功能的影响尚不清楚,更不了解两种Fgfr2功能获得性突变主要通过何种细胞内信号途径导致Apert综合征的骨骼畸形。本课题利用两种通过基因敲入手段建立的Fgfr2功能获得性突变小鼠进行研究。观察分析Fgfr2 P253R突变小鼠骨骼表型的变化,探讨该小鼠作为Apert综合征小鼠模型的可行性。同时利用多种技术手段,从细胞水平、组织水平和整体动物水平多层次、多角度地分析Fgfr2功能改变对成骨细胞、软骨细胞发育和功能的影响,初步探讨Apert综合征发病的分子遗传机制。由于骨折愈合过程与骨骼发育过程相似,而且Fgfs在骨折愈合中占有重要作用,本课题遂利用Fgfr2 S252W突变小鼠骨折模型,进一步研究了Fgfr2功能改变对实验小鼠骨折愈合的影响。主要实验结果与结论:1. Fgfr2功能获得性突变使实验小鼠呈现出类似人类Apert综合征的典型骨骼表型。包括冠状缝早闭、圆颅和短颅畸形、手足的并指/趾畸形、中脸发育不良、颅底发育不良和PF缝关闭延迟。与Wang报道的有极高新生期死亡率的Fgfr2 S252W突变小鼠相比较,Fgfr2 P253R突变小鼠存活率较高,有望成为研究Apert综合征的良好动物模型之一。2. Fgfr2分布的组织特异性和时空表达特性极大地影响Fgfr2信号的生物学效应。本研究应用ISH技术检测到Fgfr2在成骨细胞系的表达,而且进一步应用RT-PCR技术证实不仅在成骨细胞,也在骺端软骨细胞存在Fgfr2的表达,这提示通过成骨细胞和软骨细胞表面的Fgfr2,Fgfs信号能够直接对它们的发育产生调控作用。3. Fgfr2 P253R突变引起成骨细胞表达转录因子Cbfa1显著增加,使颅盖骨的成骨细胞分化加速,导致冠状缝早闭。同时本研究的结果显示Fgfr2 P253R突变对成骨细胞发育和软骨细胞发育具有不同作用,可能是Apert综合征患者同时存在冠状缝早闭和部分额状缝闭合不全体征的机制。4. Fgfr2 P253R突变小鼠出现的颅底软骨发育障碍和颅盖骨骨发育异常是各自独立的病理过程,它们的协同作用促成了Apert综合征模型小鼠出现包括短颅畸形等在内的复杂的颅骨畸形体征。5.突变小鼠的长骨纵向生长障碍直接来自于Fgfr2 P253R突变对长骨软骨内骨化过程的抑制作用。Fgfr2功能持续增强可能抑制软骨细胞增生和分化,这是Fgfr2 P253R突变小鼠发生软骨内骨化障碍的一个重要机制,它直接导致长骨纵向生长障碍。6. Fgfr2 S252W突变小鼠骨髓基质细胞体外培养诱导成骨实验提示,Fgfr2功能持续增强虽然促进成骨细胞的分化,但是可能抑制未分化的间充质细胞向成骨细胞系的分化。7. Erk1/2通路在Fgfr2功能获得性突变小鼠的冠状缝早闭和长骨生长障碍中都发挥重要作用。Fgfr2 P253R突变使Erk1/2磷酸化程度显著增强,阻断Erk1/2信号通路可以缓解体外培养的这两种器官的发育障碍。8. Fgfr2 S252W突变抑制骨折愈合过程中的软骨内成骨过程。突变型小鼠骨痂中软骨组织形成的时间明显延迟,软骨组织钙化、编织骨形成受阻,纤维骨痂和软骨骨痂长期存在。由于软骨内成骨受到抑制,X片显示在野生型小鼠骨折正常愈合后,突变型小鼠的骨折仍然未愈合。综上所述,本课题的研究结果表明新建立的Fgfr2 P253R突变小鼠是研究Apert综合征的良好动物模型之一。本课题提示Fgfr2功能持续增强可能抑制未分化的间充质细胞向成骨细胞系的早期分化,但是促进成骨细胞的分化。Fgfr2功能持续增强抑制软骨细胞的增生和分化。这样导致骨骼发育过程中膜内骨化过程异常和软骨内骨化过程受到抑制,这两者的协同作用构成Apert综合征的多个重要骨骼体征的发病机制。同时,Fgfr2不仅是骨骼发育的关键调控信号,还在骨折愈合等创伤修复中发挥重要作用。本研究为更加深入地理解Fgfr2在骨骼发育、骨骼疾病和骨骼修复中的作用提供了实验佐证。而增强的FGFR2信号对不同发育时期成骨细胞产生不同生物学效应的机制有待进一步研究。