【摘 要】
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慢性乙型肝炎(CHB)严重危害人类健康,目前尚无特效治疗手段。乙型肝炎慢性化的主要原因之一是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答,不能清除其体内的乙型肝炎病毒(HBV)。DN
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慢性乙型肝炎(CHB)严重危害人类健康,目前尚无特效治疗手段。乙型肝炎慢性化的主要原因之一是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答,不能清除其体内的乙型肝炎病毒(HBV)。DNA疫苗将编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入机体组织,外源基因在体细胞中表达后,表达产物被递呈,与主要组织相容性复合物结合,可刺激机体产生相应的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和抗体,介导细胞和体液免疫应答。 乙肝DNA疫苗可诱导机体产生抗原特异性细胞及体液免疫,接种后可诱导多种实验动物产生特异性CTL及保护性抗体,清除HBV转基因鼠血清HBsAg及HBV DNA,接种于对重组亚单位疫苗无应答的健康志愿者可产生保护性抗体。由于可诱导特异性细胞免疫,乙肝DNA疫苗有可能抑制或清除CHB患者体内的HBV,但要作为临床治疗CHB的工具尚需解决许多难题,主要是确保安全性并增强免疫效果。既往的研究大多通过联合使用免疫佐剂、细胞因子及采用不同的接种方法增强疫苗的免疫原性。本研究在乙肝DNA疫苗中插入HBV自身复制调控元件—增强子(ENH)及前S2(PreS2)、前C(PreC)抗原基因片段,通过基因调控的方法增强乙肝DNA疫苗目的基因的表达以增强DNA疫苗的免疫原性,并采用FDA已批准用于临床试验的载体VR1012构建疫苗,所构建的疫苗确保安全性,可进入临床试验进行深入研究。 本研究采用常规PCR法从adr亚型HBV全基因DNA序列中分别扩增HBsAg,PreS2-HBsAg,HBsAg—ENH Ⅰ,PreS2-HBsAg-ENH Ⅰ,HBcAg和ENH Ⅱ-PreC-HBcAg基因片段,重组到载体VR1012中,构建6种HBV重组质粒(重组质粒是乙肝DNA疫苗的主体),转染HepG2细胞及COS-7细胞,免疫BALB/C小鼠及HBV转基因鼠。采用细胞内酶免疫染色、ELISA、ELISPOT等方法检测其在HepG2细胞、COS-7细胞内的表达,BALB/C小鼠的体液、细胞免疫及HBV转基因鼠血清HBsAg、HBV DNA及肝组织病理改变。发现转染的HepG2细胞、COS-7细胞均表达相应的目的蛋白—
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