【研究背景】自1971年Folkman首次提出了实体肿瘤生长的血管依赖性以来，通过抑制肿瘤血管生成使得肿瘤内部氧气和营养物质匮乏以饿死肿瘤细胞的策略一度是肿瘤血管靶向疗法的核心思路，并催生了VEGF的人源化单抗贝伐单抗（Bevacizumab）、索拉非尼（Sorafenib）和舒尼替尼（Sunitinib）等VEGF-VEGFR信号通路的多种阻断性药物的上市。然而10年过去了，临床研究显示它们仅对结肠癌、乳腺癌等一些特定肿瘤的特定患者有效，并且随着药物的使用，耐药问题和毒副作用日益明显，另外，对于肿瘤血管生成的深入研究发现肿瘤血管结构的高度紊乱不但阻碍了化疗药物向肿瘤组织的输送，而且渗漏的血管可促进肿瘤转移，因而有学者提出了肿瘤血管正常化策略，即采用多种方式促进肿瘤血管的形态、结构和功能完整，继而与化疗药物联用，可促进化疗药物到达肿瘤组织内部并提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，从而杀死肿瘤细胞。这一思路的有效性在对脯氨酰羟化酶结构域蛋白PHD2的杂合缺失小鼠的肿瘤血管生成的研究中得到证实。PHD2家族的成员可通过感知组织中的氧气含量，靶向降解HIF家族成员而调控血管生成。PHD2单倍剂量缺失时，肿瘤血管内皮细胞之间的连接以及周细胞的募集均有所改善，表现为肿瘤血管的正常化。与化疗药物联用时，能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，因而肿瘤血管正常化策略受到了越来越多的研究者的关注，同时也呼唤新的药物靶点的出现。2011年，在发表于Nature Medicine上的一篇题为Tumor angiogenesis: molecularpathways and therapeutic targets的综述中，谈到寻找新的肿瘤血管靶点的时候，作者这样说道：我们需要寻找这样一条信号通路，第一点，它能够调控参与肿瘤血管生成的多种细胞的生长，第二点是最好具有靶向选择性。我们实验室长期从事研究的Notch信号通路对参与肿瘤血管生成多种细胞包括血管内皮细胞和周细胞等均有重要调节作用。那么它能否作为肿瘤血管正常化的新的靶点，我们是该在肿瘤血管中阻断Notch信号还是应该激活Notch信号？以及如何解决它的靶向选择性的问题呢？前期研究发现阻断Notch信号，如对Notch信号通路在血管生成中的主要配体Dll4的阻断可促进肿瘤组织血管新生，但由于新生血管的周细胞覆盖降低和血管结构不完整造成血液渗漏增加，使得肿瘤血液灌流降低从而造成肿瘤组织缺氧增加，最终减缓肿瘤的生长。在临床研究中发现，Dll4靶向siRNA和贝伐单抗的联合使用在卵巢癌的治疗中有更好的治疗效果。但是后来在小鼠、大鼠和短尾猴中的研究陆续发现Dll4的抗体能够导致血管瘤的产生，强烈限制了Dll4阻断性抗体的临床应用。另一方面，对于Notch信号激活的研究显示Notch的激活也能通过能够抑制肿瘤血管的生成而抑制肿瘤的生长。我们实验室张建平硕士的研究显示，过表达Notch配体Dll1的肿瘤生长显著减缓，并且这种减缓就是通过肿瘤血管生成的减少实现的。因而，从长期疗效来看，在肿瘤血管中激活Notch信号通路相对抑制Notch信号通路有更大的应用潜质。然而对于激活Notch信号来说，最大的挑战就是可溶性的Notch配体不能很好的激活Notch信号，甚至可能由于不能有效的介导Notch受体胞外段的内吞反而抑制了内源性的Notch信号。因而，我们拟设计一种新型的由hDll1配体的DSL结构域和RGD九肽融合组成的Notch激活型配体hD1R，借助于RGD与血管内皮细胞表面的整合素分子αVβ3的结合，促进其特异性结合于血管内皮细胞表面并促进其内吞，从而达到高效激活Notch信号的目的。综上，我们拟通过利用基因修饰小鼠模型和荷瘤小鼠模型，在进一步明确Notch信号对肿瘤血管的结构和功能的调控，尤其是有无促进肿瘤血管正常化的能力的基础上，探索Notch信号新型活化配体hD1R能否靶向内皮细胞激活Notch信号，以及对肿瘤血管的结构和功能和肿瘤生长的影响。继而，采用全基因组表达谱芯片结合分子生物学手段，对Notch信号调控血管结构和功能的分子机制进行初步探索。【研究目的】明确Notch信号对于肿瘤血管的结构和功能的调控作用，设计合成Notch信号新型活化配体hD1R，研究其能否靶向内皮细胞激活Notch信号，能否抑制肿瘤生长，能否通过活化Notch信号调节血管结构和功能，从而为肿瘤的血管靶向治疗提供新的策略和提供一种可能的候选药物。在此基础上，对Notch信号调控血管结构和功能的分子机制进行探索。【研究方法】1. Notch信号缺失对肿瘤血管结构和功能的影响利用Mx-Cre; RBP-Jflox小鼠，于小鼠出生6周后开始腹腔注射poly:I-C诱导转录因子RBP-J的在内皮细胞的敲除，诱导四次之后制作LLC荷瘤小鼠，通过肿瘤切片的免疫荧光染色观察Notch信号缺失对肿瘤血管结构和功能的影响。2.内皮细胞特异性Notch信号激活对肿瘤生长和肿瘤血管结构、功能的影响利用Cdh5CreERT; ROSAN1-IC小鼠，通过他莫昔芬的注射诱导NICD的表达，制作LLC荷瘤小鼠，观察内皮细胞特异性Notch信号活化对肿瘤生长的影响，通过肿瘤切片的免疫荧光染色观察Notch信号活化对肿瘤血管结构和功能的影响。3. hD1R的构建、表达和纯化利用PCR技术克隆目的基因，分子克隆相关技术构建原核表达载体，大肠杆菌表达体系表达目的蛋白，用镍离子螯合柱通过亲和层析的方法纯化出目的蛋白。4. hD1R的生物活性检测利用细胞爬片的免疫荧光、流式细胞和细胞粘附实验观察hD1R与内皮细胞的特异性结合；利用细胞爬片的免疫荧光、Western Blot和实时定量PCR实验观察hD1R对Notch信号的激活；利用实时定量PCR实验观察hD1R激活Notch信号是否通过促进Notch受体胞外段的内吞实现的。5. hD1R的功能实验利用管腔形成实验和内皮细胞出芽实验观察hD1R对体外管腔形成能力的影响；利用新生鼠视网膜血管新生模型做视网膜的Whole-mount免疫荧光染色观察hD1R对视网膜血管生成和Tip细胞形成的影响，视网膜切片的免疫荧光染色观察hD1R对内皮细胞增殖的影响。6. hD1R对肿瘤生长及肿瘤血管生成的影响利用裸鼠的荷瘤小鼠模型观察hD1R对肿瘤生长的影响；通过肿瘤组织切片的H&E和免疫荧光染色观察hD1R对肿瘤坏死和缺氧的影响；通过体外肿瘤细胞的MTT实验观察hD1R对肿瘤细胞增殖的影响，Annexin V和PI双标的流式细胞观察hD1R对肿瘤细胞凋亡的影响；通过肿瘤组织切片的免疫荧光染色和扫描电镜技术观察hD1R对肿瘤血管周细胞募集的影响，肿瘤血管超微结构的影响和肿瘤组织血液灌流的影响。7. D1R的毒副作用小鼠各主要器官的H&E染色观察mD1R对小鼠各器官的毒副作用；小鼠骨髓、胸腺和脾脏的流式细胞观察mD1R对小鼠免疫细胞分化的影响。8. hD1R对于正常血管的成熟和稳定的影响1） Notch信号对内皮细胞连接的影响主要通过体外培养HUVECs，做细胞爬片的免疫荧光染色和Western Blot观察hD1R或GSI对内皮细胞粘附分子VE-Cadherin和-Catenin表达变化，从而判断Notch信号改变对内皮细胞连接的影响2)对新生鼠进行hD1R皮下注射，获取视网膜血管网组织，对视网膜切片进行Lectin和-SMA的免疫荧光染色，并对共聚焦断层扫描的结果进行三维重建，观察视网膜血管的周细胞覆盖情况。9. Notch信号调节血管结构和功能可能通过的靶分子利用新生鼠视网膜血管新生模型分离小鼠视网膜血管组织，提取RNA送公司做小鼠全基因组表达谱芯片。利用MeV-TM4和GSEA软件做聚类分析寻找差异基因，用DAVID在线软件做功能分类寻找与细胞粘附和细胞外基质相关差异基因，通过实时定量对差异基因进行验证。【研究结果】1. Notch信号在内皮细胞的敲除和过度激活影响肿瘤血管的结构和功能1）利用Mx-Cre; RBP-Jflox小鼠，在内皮细胞中剔除Notch信号核心转录因子RBP-J，可减缓肿瘤细胞LLC的生长并破坏肿瘤血管的结构和功能。肿瘤体积的统计结果显示RBP-J剔除组LLC的生长受到抑制，并且肿瘤组织切片的免疫荧光染色结果显示RBP-J剔除组肿瘤组织缺氧增加，肿瘤血管基底膜形成不完整，血液灌流减少。2)利用Cdh5CreERT; ROSAN1-IC小鼠荷瘤模型，在血管内皮细胞中特异性激活Notch信号，也可显著抑制肿瘤细胞LLC的生长。肿瘤切片的免疫荧光染色结果显示，Notch信号的过度激活能够通过促进周细胞的募集和肿瘤组织血液灌流促进肿瘤血管结构和功能正常化。2.构建、表达、纯化了新型血管靶向Notch信号激活剂hD1R，证明其能靶向血管内皮，高效激活Notch信号。我们将Notch配体Dll1（Delta-Like1）的DSL结构域和整合素V3的特异性配体RGD九肽融合，在大肠杆菌中成功表达出Trx-hD1R，同时表达了Trx-hD1S（Stop终止密码子）和Trx-hD1D（DGR九肽）作为对照，镍离子螯合柱纯化得到蛋白后用Thrombin切掉Trx标签后再用镍离子螯合柱纯化得到目的蛋白。之后我们通过细胞爬片的免疫荧光、流式细胞和细胞粘附实验证实hD1R能够特异性的结合于内皮细胞膜表面，细胞爬片的免疫荧光、Western Blot和实时定量的结果显示hD1R能够在体外和体内高效的激活Notch信号，并且内吞抑制剂Dynasore能够显著抑制hD1R激活的Notch信号，说明hD1R主要是通过结合于内皮细胞膜表面促进Notch受体胞外段的内吞来高效激活Notch信号的。3. hD1R能够在体外和体内抑制血管生成。我们通过体外管腔形成实验发现hD1R能够明显抑制管腔分支数的形成和管腔长度，内皮细胞出芽实验实验发现hD1R能够明显抑制内皮细胞向外形成出芽和形成管腔。体内新生鼠视网膜血管新生模型实验发现，hD1R能够显著抑制神经节细胞层血管网的形成，并且主要是通过抑制内皮细胞的增殖和Tip细胞的形成实现的。4. hD1R能够通过抑制肿瘤血管生成抑制肿瘤生长。我们通过裸鼠的荷瘤小鼠模型证实了hD1R能够抑制U87、LLC和MCF-7的生长，肿瘤组织切片染色发现肿瘤坏死区域明显增加，肿瘤组织缺氧明显增加。CD31的免疫荧光染色显示hD1R组，血管生成明显降低，并且hD1R与CD31有明显的共定位，表明hD1R通过抑制了肿瘤组织血管生成从而造成肿瘤组织中坏死的增加和缺氧的增加而抑制肿瘤的生长。另外肿瘤细胞的MTT实验结果表明，hD1R对肿瘤细胞的增殖没有影响，肿瘤细胞Annexin V和PI双标的流式细胞结果发现hD1R蛋白对肿瘤细胞的凋亡没有影响。5. hD1R能够促进肿瘤血管结构和功能正常化。肿瘤组织CD31和NG2双标的免疫荧光染色结果发现，hD1R处理组肿瘤血管周细胞的覆盖明显增加；扫描电镜结果发现，相比于对照组肿瘤血管内存在大量纤维物质和血管周存在外渗漏样物质，hD1R处理组肿瘤血管的结构明显有所改善；小鼠尾静脉注射Lectin检测肿瘤组织血液灌流情况，结果发现hD1R组Lectin阳性信号明显增加，表明hD1R促进了肿瘤组织血液灌流。以上这些结果表明hD1R激活的Notch信号能够促进肿瘤血管结构和功能的正常化。6. D1R在小鼠体内无毒副作用。我们通过小鼠主要器官包括大脑、心、肝、肺、肾的H&E染色结果发现，D1R蛋白处理组小鼠的主要器官并没有发生明显的病变。流式细胞结果发现D1R蛋白对小鼠骨髓B细胞、胸腺T细胞、脾脏B细胞和脾脏T细胞的分化没有影响。7. Notch信号参与调节生理性血管的结构和功能。我们通过Western Blot和细胞爬片的免疫荧光染色结果发现hD1R能够上调粘附连接蛋白VE-Cadherin和-Catenin的表达，Notch信号阻断剂GSI能够显著抑制其表达。另外细胞爬片的免疫荧光染色结果发现GSI的处理能够导致-Catenin的定位由由胞膜转向胞浆。利用Mx-Cre;RBP-JFlox小鼠剔除血管内皮细胞的Notch信号核心转录因子RBP-J结果发现，剔除组小鼠视网膜和大脑的上丘脑有明显的血液渗漏的情况。利用新生鼠视网膜血管新生模型通过视网膜切片的Lectin和-SMA双标的免疫荧光染色结果发现，hD1R组-SMA阳性的周细胞明显增加。我们将共聚焦断层扫描的结果进行三维重建，结果发现hD1R组血管周围绿色标记的-SMA信号明显多于对照组。以上的这些结果表明Notch信号能够通过调节细胞连接的形成和周细胞的募集来调控生理性血管的结构和功能。8. Notch信号可能通过LAMB1、PCDH18、ANGPTL4和HSPG2调节血管结构和功能。我们将给予DMSO和GSI注射的新生鼠视网膜血管组织分离，提取RNA，做全基因组表达谱芯片。我们利用MeV-TM4软件做聚类分析，找出变化显著的差异基因231个，利用GSEA软件找出113个变化有趋势的差异基因，将这344个差异基因用DAVID在线软件分析，从中找出17个细胞粘附相关差异基因和9个细胞外基质相关差异基因，并通过实时定量筛选出LAMB1、PCDH18、ANGPTL4和HSPG2四个基因可能为Notch信号的下游靶基因。【结论】在血管内皮细胞剔除Notch信号信号关键转录因子RBP-J可显著破坏肿瘤血管的结构和功能，并减缓肿瘤生长。在血管内皮细胞上特异性激活Notch信号通路也可抑制肿瘤生长，并且促进了肿瘤血管结构和功能的正常化。以上结果说明Notch信号对肿瘤血管生成和肿瘤血管的结构、功能具有重要调控作用。在此基础上，本研究成功构建、表达和纯化了一种新型的血管靶向Notch配体hD1R，其能在体外、体内特异性的结合于内皮细胞膜表面，通过促进Notch受体胞外段的内吞高效激活Notch信号。功能研究发现hD1R能在体外、体内抑制管腔形成和血管生成，并且是通过抑制内皮细胞增殖和Tip细胞形成实现的。hD1R可以通过抑制肿瘤组织血管生成造成肿瘤组织坏死增加和缺氧增加从而抑制肿瘤的生长，并且hD1R可以促进正常血管的成熟和稳定以及肿瘤血管结构和功能正常化。进而采用全基因组芯片分析和定量PCR验证以及后续的生物信息学分析，我们推测Notch信号可能通过调节LAMB1、PCDH18、ANGPTL4和HSPG2等分子的表达来调控血管结构和功能。