低温影响水稻的产量和品质,是限制水稻复种面积扩大的重要因素之一。水稻冷害一般分为芽期冷害,苗期冷害,孕穗期冷害,水稻在孕穗期对低温最为敏感。在孕穗期遭遇低温,会引起花粉不育,从而导致穗部结实率降低,最终严重影响水稻产量。为了挖掘孕穗期耐冷基因,研究耐冷机制,为耐冷育种提供理论基础和指向。我们用关联分析研究水稻芽期与孕穗期耐冷性并进行耐冷QTL的发掘,对孕穗期耐冷基因进行克隆与功能验证。主要的结果如下:1、利用174份核心种质材料进行耐冷鉴定,273对SSR引物对水稻的芽期和孕穗期耐冷性进行关联分析。通过分析,核心种质材料分为籼稻与粳稻两个亚群;表型分析的结果表明,两个亚种对低温较为敏感,粳稻在低温下的发芽率,低温下的结实率均高于籼稻;不同处理下的表型的相关性分析表明,芽期耐冷性与孕穗期耐冷性仅微正相关。研究定位了 51个耐冷QTL在12条染色体上,22个为芽期耐冷QTL,33个为孕穗期耐冷QTL。8个QTL在籼稻与粳稻中至少与两个指标相关。46%的QTLs为新的耐冷位点。仅有一个QTL((qLTSSvR6-2)在两个亚种中同时与一个指标相关。分析了增效基因型和耐冷指标的关系。18个增效基因型和21个减效基因型在籼稻中出现,19个增效基因型和24个减效基因型在粳稻中出现。减效基因型在两个亚种中的减效效应均比增效基因型的增效效应大。在一个品种中的增效基因型能够起增效作用,但是未必能在另一个品种中起增效作用。减效基因型的发现,有助于分子育种中有效规避冷敏感的位点。2、前人利用云南地方品种强耐冷高原粳稻昆明小白谷和日本冷敏感平原粳稻十和田构建群体,精细定位了 4号染色体孕穗期耐冷QTL qCTB4-1,并克隆了其中一个候选基因,命名为qCTB4-1-1。本研究在此基础上,对qCTB4-1-1进行功能验证,并对精细定位区段内的候选基因qCTB4-1-2进行克隆及功能验证。研究结果发现:i.通过测序比对,发现两个亲本中的候选基因qCTB4-1-1在CDS上有7处SNP。通过对超表达植株进行的耐冷鉴定,推测qCTB4-1-1在发芽期耐冷作用较微弱；在幼穗分化期遭受低温,qCTB4-1-1能够通过减少一次枝梗数的损失,从而降低主穗产量和单株产量的损失。在孕穗期遭受低温,qCTB4-1-1通过保持花粉室的完整,减少败育花粉数,从而保证主穗结实率。因此qCTB4-1-1能够提高水稻生殖生长期的耐冷性。ii.qCTB4-1-1编码一个膜蛋白,与对照相比,qCTB4-1-1在长期的低温胁迫下,有效降低细胞膜透性,降低丙二醛含量,提高脯氨酸含量。qCTB4-1-1表达量较低,在苗期的叶和根中通过镜检GUS染色检测到在苗期的叶中表达,qCTB4-1-1在孕穗期的叶、穗和花药中有所表达。受到低温诱导表达,同时过表达qCTB4-1-1基因影响部分抗逆基因的表达。iii.对65份材料进行定点测序,进行qCTB4-1-1的单倍型分析。仅发现4份材料的基因型完全与昆明小白谷一致。未发现与十和田基因型完全一致的材料。发现424-bp处C>T是一个与结实率高度相关的位点。3、前人利用云南地方品种强耐冷高原粳稻昆明小白谷和日本冷敏感平原粳稻十和田构建群体,精细定位了 4号染色体孕穗期耐冷QTL qCTB4-1,并克隆了其中一个候选基因,命名为qCTB4-1-1。在同一个定位区间内含有第二个CDS发生改变的基因,我们克隆了精细定位区段内第二个候选基因qCTB4-1-2。该基因编码一个葡糖转基酶。该基因的CDS上发生了 2个碱基的突变。通过对qCTB4-1-2的过表达植株芽期低温处理,发现qCTB4-1-2在芽期的耐冷性并不明显。通过对转基因植株在孕穗期进行低温处理,发现过表达转基因植株在单株产量,主穗结实率方面均比对照高。qCTB4-1-2启动子上含有多个抗逆途径的顺式元件,组织化学染色表明该基因在孕穗期的叶、穗、茎中表达。qCTB4-1-2编码的葡糖转基酶较为保守,是一个在真菌和高等植物中普遍存在的蛋白。亚细胞定位显示该基因定位在细胞膜和细胞核上。