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棉花是世界重要的经济作物之一。棉纤维是种子的表皮细胞经过一系列发育调控形成的,由于其单细胞结构和高含量纤维素组成的优点,成为基础和应用研究的主要模式材料。因此,从分子水平阐明棉纤维发育的机理,具有重要的理论价值与现实意义。本研究以显性光子N1、隐性光子n2、Xuzhou-142无绒无絮、新乡小吉无绒无絮(XinWX)、新乡小吉无绒有絮突变体(XinFLM)和李氏超短纤维突变体Lil为研究材料,利用分子生物学和细胞学手段揭示了纤维起始发育过程,克隆了控制纤维伸长发育相关的两个重要基因并初步验证了它们的功能,为进一步深刻了解纤维发育的分子机理并为后续转基因研究提供了基因资源。棉纤维是来自于胚珠外表皮细胞的单细胞毛状体,明确纤维细胞的发育模式和系统阐明棉纤维发育和调节的分子机理将为充分利用棉花自身资源、提高棉花产量、改良纤维品质甚至开发人造纤维产生巨大作用。纤维发育突变体为阐明纤维发育的机理提供了优异的资源材料。在本研究中,我们利用扫描电镜技术比较和分析了不同陆地棉基因型长纤维和短绒发育的差异,这些突变体包括：显性光子N1、隐性光子n2、Xuzhou-142无绒无絮、新乡小吉无绒无絮(XinWX)和新乡小吉无绒有絮突变体(XinFLM),以遗传标准系TM-1为对照,每个材料的-1DPA、0DPA和1DPA的胚珠用于比较长纤维的差异,4DPA和5DPA的胚珠用于观察短绒间的差别。结果表明：TM-1的长纤维起始集中在开花当天,在花后一天(1DPA)就开始明显伸长；而短绒开始于4DPA,短绒突起的形状与长纤维不同；胚珠表面纤维突起最早的部位在脊突处。与TM-1相比较,N1和XinFLM表现为起始延迟,即在开花当天胚珠表面没有突起；而且五个突变体的突起密度都低于对照的。另外,两个无绒无絮棉在发育早期也有个别突起,但突起形状是凹陷的,不能有效的发育成纤维。上述研究结果为后续关于纤维和短绒的确切发育时期和克隆重要的纤维发育基因奠定了理论基础。基于上述突变体N1和XinFLM延迟发育的现象,我们以n2和TM-1作为双重对照,利用GhE6、GhEXP1、GhMYB1、GhMYB5、GhMYB6、GhMYB25、GhMYB36和GhTTG1-GhTTG4等纤维启动和发育相关基因的RT-PCR分析。结果表明相对于正常发育材料,GhEXP1和GhMYB25在延迟发育材料中的表达很低。根据这两个基因的信息,我们进一步设计了以下处理：在体用30%H202、H20和稀释400倍的乙烯利注射XinFLM-1DPA的胚珠；用酸性BT (pH=3-4)培养基和添加有IAA (100uM)知GA3(100uM)的BT培养基离体培养XinFLM-1DPA。结果发现用30%H202注射植株子房能诱导XinFLM的表面纤维突起,而所有的处理对N1没有显著的影响。为了进一步弄清楚基因表达和H202的关系,利用定量RT-PCR分析1XinFLM-1DPA胚珠在H202和H20注射处理24小时后、未处理的XinFLM和TM-1的基因表达情况,结果发现：在H202处理后,GhMYB25知GhEXP1的表达相对于未处理胚珠和水处理胚珠有显著的差异,前者显著上调,而后者则显著下调,这暗示H202可能是二者的一个上游信号分子。WD-repeats基因在蛋白运输、RNA加工和信号转导过程中起着重要的作用,我们利用DDRT-PCR和RACE-PCR的方法克隆和鉴定了一个陆地棉WD40基因,并且通过转化和亚细胞定位的方法初步分析了它的功能。时空表达分析说明该基因是组成型的,并且在纤维快速伸长的过程中表达丰度较高；Southern杂交显示该基因在四倍体棉花基因组中有两个拷贝；利用生物信息学软件预测该蛋白序列没有核定位信号,但亚细胞定位分析表明该蛋白定位于细胞壁和细胞核；棉纤维、拟南芥叶片和棉花叶片的瞬时表达分析表明该蛋白位于这些单细胞结构的基部组织,转基因拟南芥GUS染色也主要分布在表皮毛细胞的基部。通过构建WD40基因的两个缺失载体进行亚细胞定位分析,揭示出一些氨基酸对于核定位的重要性。在酵母细胞中过量表达该基因可以使酵母细胞显著变宽,说明该基因参与了极性生长；另外,该基因与腺体和气孔的发育与调节有一定的关系,对ABA有一定的响应。Rab1 1在蛋白运输过程中,尤其是新的细胞膜和细胞壁成分向目标部位运输和旧的膜组分再利用过程中起重要作用。本研究克隆了一个在突变体棉花中表达丰度高的GhRAB11c基因,发现在野生型纤维的起始和伸长期(-3-20DPA)基本不表达,在23DPA以后即次生壁加厚期表达增强,而在突变体中则随着发育的进程表达渐强,这表明该基因在纤维发育的过程中起负调控作用；Southern杂交显示该基因在四倍体棉花基因组中有一个拷贝；亚细胞定位表明该蛋白位于细胞壁,并且呈极性分布；拟南芥稳定转化和拟南芥叶片瞬时转化实验同时表明该蛋白特异地在叶片表皮毛部位发挥作用；而且能使酵母细胞的长度极显著变短,说明其参与了极性生长；体外胚珠纤维转化和胚珠培养实验结果表明该蛋白使纤维不能正常伸长；6DPA的纤维瞬时转化实验和柿子胚乳细胞的转化、透射电镜实验同时表明该蛋白参与了高尔基体的囊泡运输；该基因位于染色体A8上；DAB染色实验也表明其参与了双氧水信号通路。该实验暗示李氏突变体可能是由于双氧水的早期产生促使其纤维较早的进入次生壁加厚期,而最终导致纤维不能伸长的表型。