从肝素生产废弃物中分离纯化硫酸皮肤素及其功能性评价

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硫酸皮肤素(Dermatan sulfate,DS)是动物机体内一种重要的黏多糖,本文旨在研究从肝素生产废弃物中分离纯化DS的方法,并对其抗氧化与护肤作用进行评价。  本文采用sevag法、凝胶过滤层析法、CPC西吡氯铵法、有机试剂分级沉淀结合弱阴离子交换色谱法对肝素生产废弃物中的DS进行纯化,筛选了乙醇、丙醇、丙酮三种沉淀剂进行分级沉淀。结果显示sevag法、凝胶过滤层析法和CPC西吡氯铵法的纯化效果较差。沉淀剂筛选时通过对各沉淀级分的醋酸纤维素薄膜电泳结果进行分析,发现丙酮法效果最好,级分14与15中DS含量占三种黏多糖组分的100%,随后通过DEAE-650S弱离子交换层析进一步分离,样品经红外光谱(IR)与核磁共振(NMR)鉴定、高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定纯度,证明得到了高纯度的DS,产品纯度为94.29%,相对于未处理原料的提取率为1.91%。  利用硫酸软骨素ABC酶将DS样品酶解,强阴离子交换高效液相色谱(SAX-HPLC)对酶解所得二糖检测,结果表明样品DS主要二糖重复单元为2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-4-O-磺基-D-半乳糖(△di-4S),还含有少量的2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-D-半乳糖(△di-0S)和2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-6-O-磺基-D-半乳糖(△di-6S),三种不饱和二糖△di-0S、△di-6S和△di-4S的摩尔比为1.0∶1822.5∶62707.2,进一步验证该样品为DS而非其它黏多糖。高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定样品DS的分子量为80220。  研究了用于评价羟基自由基清除能力的Fenton-罗丹明B反应体系中H2O2浓度、FeSO4浓度、H2SO4浓度对体系稳定时间的影响并修正反应条件,评价了样品DS对羟基自由基的清除能力并与抗坏血酸(VC)进行对比,两者的半抑制浓度IC50分别为0.288g/L与0.199g/L。修正了用于评价超氧阴离子自由基清除能力的邻苯三酚体系的反应条件,评价了样品DS清除超氧阴离子自由基能力并与超氧化物歧化酶(SOD)对比,两者的半抑制浓度IC50分别为0.121g/L与0.017g/L。  利用Corneometer体内法分别对不同浓度的DS和硫酸软骨素(CS)配方啫喱进行了皮肤保湿功效评价,并与透明质酸(HA)的保湿效果进行比对。结果表明在涂抹0.05%DS、0.1%DS、0.3%DS配方啫喱4h内,志愿者皮肤水分含量平均值增加明显(p<0.05),皮肤水合率分别上升至37.85%、42.25%和44.90%,表明该浓度下DS保湿效果明显,且优于HA;而涂抹0.05%CS、0.1%CS、0.3%CS配方暗喱4h内,志愿者皮肤水分含量平均值增加明显(p<0.05),表明该浓度下CS保湿效果明显,皮肤水合率分别上升至37.72%、41.79%和44.65%,且优于HA。DS与CS相比使用后皮肤水合率变化差异性不明显,因此两者保湿效果差异不明显。  采用人体皮肤丹磺酰氯染色法,评价了DS和CS配方乳液对促进皮肤角质代谢(剥脱)的效果。结果表明每日两次涂抹含0.5%DS乳液与每日两次涂抹含0.5%CS乳液部位的荧光平均消退时间,分别比涂抹空白乳液增快9.43%和11.53%,两者效果差异性不明显,DS及CS具有促进皮肤表皮更新的作用(p<0.05)。
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