论文部分内容阅读
随着人们生活水平的提高,蔬菜的食品安全问题日益受到民众关注。戊唑醇（Tebuconazole,TEB）作为一种杀菌剂,被广泛应用于拌种及植物叶面喷施,可以有效防治各种真菌病害,但其在农产品中的残留问题,引发民众的关注,研发可快速、现场检测的检测方法是关键。目前对TEB的残留检测多以仪器分析方法为主（例如气相色谱分析法、高效液相分析法等）,方法精确度高,可以准确的定性、定量,但也存在操作复杂且耗时长,对于现场快速反应检测,以及大量样品的快速筛检存在缺陷。免疫检测技术作为快速检测分析技术的一种,具有简便、高效、高通量等优点,高质量的抗体及信号示踪是实现其高灵敏检测的关键。本研究通过戊唑醇半抗原设计改造,获得了高亲和力和高特异性的戊唑醇单克隆抗体,而后分别建立ic-ELISA方法、胶体金免疫层析试纸条（GICA）和量子点荧光微球免疫层析试纸条（QBs-FITSA）,可实现了农产品中戊唑醇残留的快速分析,主要研究结果如下:1.戊唑醇半抗原的改造与人工抗原合成,分别采用活泼酯法和混合酸酐法偶联合成人工免疫原（TEB-BSA）、人工包被原（TEB-OVA）。将TEB-BSA免疫BALB/c小鼠,进行细胞融合得到杂交瘤细胞株E3-H11,同时制备腹水并纯化得到TEB单克隆抗体（0.62 mg/mL）,测定抗体亚型为IgG1。2.ic-ELISA方法的建立:优化抗体及包被原的工作浓度与工作条件,建立了ic-ELISA方法,对戊唑醇的检测线性范围为0.039～1.25 ng/mL,曲线方程为y=24.318ln（x）+87.491（R2=0.994）,IC50为0.214 ng/mL,IC20为0.071 ng/mL,远低于50 ng/mL的国家TEB最低残留限量（MRL）,对其他三唑类杀菌剂均无交叉反应,特异性高。3.胶体金免疫试纸条的制备（GICA）:优化TEB单克隆抗体的标记量、pH值等条件,在pH=7时1 mL胶体金溶液加入9.6 μL TEB-mAb（0.62 mg/mL）为最佳标记量。同时优化检测线（T线）包被原（TEB-OVA）的浓度、质控线（C线）羊抗小鼠IgG的喷涂浓度条件分别为0.3、1.0 mg/mL,喷涂量均为0.6 μL/cm。制备的胶体金免疫试纸条对TEB的裸眼最低检测值为6.25 ng/mL,与丙环唑、腈菌唑、多效唑和己唑醇均无交叉反应。4.量子点荧光微球免疫层析试纸条的制备（QBs-FITSA）:在优化抗体标记量和pH条件下,制备获得最佳的量子点荧光微球-抗体结合物探针（QBs-mAb）,pH最佳条件为 6.5,1 μL 的 QBs（12.5 mg/mL）偶联 14 μL TEB-mAb（0.62 mg/mL）为最佳标记量;优化试纸条T线（TEB-OVA）和C线（羊抗小鼠IgG）包被浓度为TEB-OVA:0.6 mg/mL;IgG 二抗:0.8 mg/mL,喷涂量均为 0.6μL/cm,QBs-mAb 探针用量为 0.6μL,建立了基于荧光强度比值（FIT/FIC）的戊唑醇定量计算方程y=-19.2ln（x）+15.485（R2=0.987）,IC50为0.166 ng/mL,IC10为0.021 ng/mL,检测范围为0.02～1.25 ng/mL。5.建立LC-MS/MS方法检测,对黄瓜、甘蓝样品的平均添加回收率为79%～95%,建立LC-MS/MS方法检测条件,在2.5～200 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数为0.998,最低检出限为1 ng/mL。方法验证建立的GICA和QBs-FITSA方法与仪器检测（LC/MS-MS）结果相吻合。QBs-FITSA方法的平均添加回收率为70.0%～95.0%。表明建立的QBs-FITSA具有较高的灵敏度、可靠性和良好的实用性。