论文部分内容阅读
朊病毒病(prion disease)又称可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)是一类人畜共患的的慢性致死性中枢神经系统退行性疾病,在来源上有自发性、遗传性和感染性三种形式。迄今为止正常朊蛋白(PrP)的生理功能仍未完全清楚,但目前认为PrP在神经信号传导、参与铜代谢、抗氧化活性、细胞黏附和识别、脂类摄取以及形成记忆中起着重要的作用,其抗氧化功能主要表现为超氧化物歧化酶(SOD)样活性,并且在体内参与了抗氧化应激功能。prp的SOD活性是铜依赖性的且与构象有密切的联系,其八肽重复区、疏水区以及C端的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚都对其SOD活性有不同程度的影响,特别是其八肽重复区的影响最为明显,八肽重复区缺失和仅有一个八肽重复区时的小鼠PrP突变体不表现出SOD活性,但带有两个八肽重复区时即可表现出SOD活性。
目前,有研究认为在朊病毒病发展过程中,整个机体对活性氧(ROS)的损伤更加易感,导致了组织和重要器官特别是中枢神经系统的进行性氧化损伤从而出现朊病毒病的病理生理状态。散发性CJD病人的脑组织中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活力均出现明显的降低,同时有研究人员使用抗氧化剂,如:NADH、维生素E、α-脂酸及多种维生素制剂和新鲜的水果蔬菜汁对一名确诊的CJD病人进行治疗并取得了一定效果。因此,研究PrP与SOD活性可能为今后对于正常朊蛋白的了解和朊病毒病的致病机制以及预防和治疗这类疾病带来新的方法。
将野生型PrP PG5(5个八肽重复插入)、具有9个八肽重复插入的突变体(PG9)蛋白及C端PrP(90-231)蛋白进行了纯化,在复性过程中使其与金属离子结合并测定它们的SOD活性;利用细胞转染技术,将带有PG5和PG9哺乳动物细胞表达重组质粒,分别瞬时转染HeLa细胞,比较两种质粒转染后HeLa细胞的总SOD活性,并比较了金属离子对转染细胞的总SOD活性影响。
实验结果显示与5 mmol/L Cu<2+>结合的体外重组野生型PrP蛋白的SOD活性高于在去离子水中复性的重组野生型PrP蛋白。在5 mmol/L Cu<2+>中进行透析复性的PG9蛋白SOD活性高于野生型PrP PG5蛋白SOD活性。在Cu<2+>存在的情况下,PrP C端(90-231)蛋白几乎没有SOD活性。而将PG5蛋白在相同浓度(5mmol/L)的不同二价金属离子中透析复性,结果显示,Cu<2+>存在的情况下PG5蛋白的SOD活性明显高于在相同浓度下Zn<2+>和Mg<2+>中透析后的PG5蛋白的SOD活性,SOD活性高低依Cu<2+>>Zn<2+>>Mg<2+>变化。
我们还发现,瞬时转染野生型PrP质粒后HeLa细胞的总SOD活性大小与PrP的表达量的高低呈现出正相关,在常规培养液条件下表达了含有9个八肽重复插入突变体(PG9)的HeLa细胞总SOD活性仅略高于野生型PrP(PG5)。此外在转染了野生型PrP后,细胞在终浓度为20 μmol/LCu<2+>中的总SOD活性要高于相同终浓度的Mg<2+>、Zn<2+>及未加入金属离子的细胞总SOD活性。这些结果证实PrP蛋白具有SOD样活性,其酶活性区域位于PrP蛋白N端的八肽重复序列,Cu离子可以明显增强蛋白的SOD活性,在实验条件下,SOD活性的强弱与八肽重复序列的数量相关。