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研究背景:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是病死、致残比例较高的疾病,生存者常伴随不同程度神经功能损害。有研究证明SAH后继发性脑损伤机制复杂,即使采用积极有效的治疗手段,患者预后依然欠佳。自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)是固有免疫中重要的识别、效应细胞,参与机体抗感染、抗肿瘤和免疫调节等进程,在中枢神经系统非感染性疾病病程中扮演重要角色。研究目的:从免疫致病机理的角度出发,对蛛网膜下腔出血的分子机制进行探讨,并首次将NK细胞这一重要固有免疫细胞引入中枢神经系统出血性疾病的研究,通过临床病例回顾研究与实验室基础研究相结合的方式,探讨NK细胞在蛛网膜下腔出血中的重要价值。研究方法:前期研究中我们采集脑胶质瘤患者肿瘤组织行免疫组织化学染色,分析NK细胞表面受体配体B7-H6表达与临床参数的相关性。通过RNA干扰技术,观察下调B7-H6表达对胶质瘤细胞系增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期等细胞生物学功能的影响,从而印证NK细胞及其表面分子在中枢神经系统非感染性疾病中的重要作用。第二步通过采集临床蛛网膜下腔出血患者临床资料以及外周血标本,基于流式细胞术分析NK细胞及其亚群比例随时间相变化情况,应用Logistics回归分析和Kaplan-Meier生存分析评价NK细胞相关数值的临床价值。第三步构建大鼠蛛网膜下腔出血模型,通过免疫组织化学、荧光染色,以及Western blot、实时定量RNA方式验证SAH后脑组织中NK细胞浸润程度,以及相关时间相数据是否能与临床结果具有一致性。第四步构建小鼠蛛网膜下腔出血模型,通过腹腔注射单抗的方式下调NK细胞数量。通过神经功能学评分、免疫组化及免疫印迹的方式验证下调NK细胞对SAH小鼠模型神经功能,以及对脑内经典Wnt/β-Catenin神经保护通路的影响。结果:前期研究:NK细胞表面受体配体B7-H6在人脑胶质瘤组织中高表达,且不同病理类型(Z/x2=23.935,P<0.001)、WHO 分级(Z/x2=3.008,P<0.01)以及组织类型(Z/x2=13.908,P＜0.01)差异有统计学意义;CCK-8增殖实验结果显示B7-H6下调后72h,细胞系增殖水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。划痕实验结果表明,24h后B7-H6下调组的细胞系划痕愈合速度低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验表明,B7-H6下调组与对照组相比,24h后侵入的细胞数量显著减少,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞周期分析结果表明,下调B7-H6表达后,G1期细胞比例增多,G2/M期细胞比例减少,细胞周期出现阻滞。临床研究:蛛网膜下腔出血患者不同时间相的外周血中NK细胞百分比以及亚群组成上存在明显差异,3-6日时NK细胞百分比明显下降,差异有统计学意义(F=7.77,P<0.01);NK 细胞亚群比例(CD16+CD56bright 亚群相对 CD16+CD56dim的比例)明显下降,差异有统计学意义(F=8.57,P＜0.01)。根据SAH后3-6日NK细胞亚群比例将患者分为两组,组间Hunt-Hess具有显著差异(F=10.33,P<0.01)。分组间患者死亡事件具有显著差异(x2=7.19,P=0.02),改良Rankin评分有显著差异(F=10.46,P<0.01),生存也具有显著差异(x2=7.198,P=0.007)。有序Logistics回归分析示NK细胞亚群比例对改良Rankin评分具有显著影响(P=0.004,95%CI:1.106-5.762)。大鼠蛛网膜下腔出血动物模型研究结果:在SAH后24h出现NK细胞浸润(F=42.62,P<0.0001)。在24h时脑组织中NK细胞表面受体CXCR3蛋白表达显著升高(F=10.62,P<0.05),48h 时同样升高(F=6.13,P＜0.05)。KLRC3 在 24h时显著升高(F=5.98,P<0.05)。NK细胞招募相关蛋白IP-10 mRNA在SAH后6h表达升高(F=16.19,P<0.05)。IFN-γ mRNA在12h时表达下降,差异有统计学意义(F=13.90,P<0.05)。穿孔素Prf-1mRNA在12h、24h时表达升高,差异有统计学意义(F=10.70,P<0.05;F=14.58,P<0.05)。小鼠蛛网膜下腔出血动物模型研究结果:NK细胞下调组与对照抗体组相比神经功能学评分下降,差异有统计学意义(F=5.18,P<0.05)。SAH后24h时Wnt通路中APC蛋白表达升高,差异有统计学意义(F=10.84,P<0.01):β-连环蛋白下降,差异有统计学意义(F=8.59,P<0.05);磷酸化β-连环蛋白蛋白表达上升,差异有统计学意义(F=25.01,P<0.01);下游Survivin蛋白表达下降,差异有统计学意义(F=19.50,P<0.01)。结论:NK细胞及其表面分子在中枢神经系统非感染性疾病中起到重要作用:在蛛网膜下腔出血中外周血NK细胞及其亚群比例变化具有临床预判价值。NK细胞在SAH后脑组织中浸润,在脑损伤中可能通过激活Wnt通路起到神经保护作用。