正己烷（n-Hexane）是一种具有蓄积毒性的常用工业有机溶剂,由于其职业暴露人群众多且呈女性化、年轻化的特点,正己烷及其主要毒性代谢产物2,5-己二酮（2,5-HD）对女性健康的影响特别是生殖健康的影响日益受到关注。目前国内外研究表明,正己烷及2,5-HD可导致女（雌）性生殖功能损害,干扰卵巢颗粒细胞的生存与凋亡进而损害卵巢可能是其重要毒性机制之一。细胞凋亡涉及非常复杂的调控机制,其中细胞周期的进展是决定细胞增殖或凋亡的重要条件。调节细胞周期正常进程的基因表达异常则会导致细胞周期紊乱。miRNA作为重要的表观遗传调控方式之一,可在转录后水平调控基因的表达进而调节细胞功能,包括调节细胞周期。另外,有研究表明在颗粒细胞的发育及功能中miRNA调控发挥关键作用。因此,本研究通过体外染毒模型,结合miRNA和mRNA芯片技术,从转录后水平探讨miRNA参与调控的关键信号通路在2,5-HD致卵巢颗粒细胞周期阻滞中的作用,旨在从系统性的角度初步分析miRNA介导的表观遗传学调控是否参与其中,以及可能的关键靶点,为进一步揭示正己烷的卵巢毒性机制提供实验依据。同时,为探索正己烷的卵巢毒性干预靶点提供新的思路,这对于制定合理有效的职业卫生防治措施,保护正己烷职业暴露女工的生殖健康具有重要的现实意义。第一部分卵巢颗粒细胞2,5-HD体外染毒后mRNA和miRNA表达谱分析目的:通过对2,5-HD染毒后miRNA和mRNA表达谱进行生物信息学分析,从转录后水平探讨2,5-HD致卵巢颗粒细胞毒性损伤过程中miRNA可能的调控作用,进一步寻找其可能介导的关键生物学效应及信号通路。方法:1、21日龄雌性SD大鼠,双侧卵巢提取原代颗粒细胞培养,2,5-HD（0 mmol/L、60 mmol/L）染毒24 h。应用miRNA和mRNA芯片技术,比较分析两组细胞的miRNA和mRNA表达谱,筛选出差异表达的miRNA和mRNA;2、利用在线数据库预测差异表达miRNA的靶基因,构建miRNA-mRNA共表达关系网络,并进一步将共表达网络中的靶mRNA进行功能富集分析,包括GO分析和KEGG分析;3、筛选与细胞周期和Wnt通路相关的miRNA,从中挑选7个miRNA,大鼠卵巢颗粒细胞2,5-HD（0mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L）染毒24h,RT-PCR检测其表达情况,验证miRNA芯片结果。结果:1、根据（Fold Change≥2,P≤0.05）的标准,本次芯片分析共获得5678个差异表达的mRNAs,其中2982个上调,2696个下调;32个差异表达的miRNAs,其中13个上调,19个下调;2、miRNA-mRNA共表达分析1)利用miRWalk、miRanda、Target Scan三个数据库分别预测DEMs的靶基因与DEGs取交集,并筛选与对应miRNA呈负相关关系的mRNA。三个数据库的结果取交集后共获得纳入网络的靶mRNA 262个,与27个miRNA形成368对miRNA-mRNA共表达关系对,并进行可视化。2)GO分析-生物学过程分析结果提示,共表达网络中靶mRNA富集到的排名前20的GO条目中,有3条与细胞周期相关（GO0006977、GO0007050、GO0051726）,2条与经典Wnt通路相关（GO0090090、GO0060070）;3)KEGG分析结果显示,共表达网络中靶mRNA显著富集到46条信号通路,按照-log（P-Value）的值排序得到前30个通路,Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）排在第10位,细胞周期通路（Cell cycle）排在第23位;3、从15个可能参与调控细胞周期和Wnt信号通路的miRNA中挑选7个miRNA进行RT-PCR验证,结果显示,与对照组相比,各剂量组rno-miR-3473的表达水平均上升（P<0.05）,各剂量组rno-miR-214-3p、rno-miR-138-5p和rno-miR-199a-3p的相对表达量降低（P<0.05）,40mmol/L、60mmol/L剂量组的rno-miR-145-5p和rno-miR-143-3p相对表达量降低（P<0.01）,而各剂量组rno-miR-196a-5p的相对表达量没有明显变化。PCR的结果与miRNA芯片的结果基本一致。第二部分Wnt/β-catenin通路在2,5-HD致卵巢颗粒细胞周期阻滞中的作用及可能机制目的:利用体外染毒实验,研究2,5-HD对大鼠卵巢颗粒细胞周期的影响,并进一步探讨Wnt/β-catenin通路在其中的作用及可能机制。方法:1、2,5-HD（0mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L）染毒颗粒细胞24 h后,检测颗粒细胞周期分布情况,以及细胞周期相关基因mRNA的表达水平;2、2,5-HD（0mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、60mmol/L）染毒颗粒细胞24 h后,检测Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA和蛋白的表达水平;3、2,5-HD（0 mmol/L、10 mmol/L、20mmol/L）染毒人卵巢颗粒瘤细胞6 h后,双荧光素酶报告基因检测β-catenin入核介导的转录活性。结果:1、流式细胞术结果显示,2,5-HD染毒卵巢颗粒细胞24 h后,与对照组相比,各剂量组G0/G1期细胞比例均升高（P<0.05）,各剂量组S期细胞比例均下降（P<0.05）,G2/M期细胞比例在40mmol/L和60mmol/L剂量组发生下降（P<0.05）;2、RT-PCR结果显示,2,5-HD染毒24 h后,与细胞周期密切相关的P21、Cdk2、Ccnd1基因mRNA表达均发生显著改变:与对照组相比,各剂量组P21 mRNA相对表达量升高（P<0.05）;各剂量组Cdk2 mRNA相对表达量随着染毒剂量的升高而下降（P<0.05）,各剂量组Ccnd1 mRNA相对表达量呈剂量依赖性下降（P<0.01）;3、Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA和蛋白的表达情况1)RT-PCR结果显示,2,5-HD染毒24 h后,与Wnt/β-catenin信号通路相关的8个基因mRNA表达均发生变化:与对照组比较,各剂量组Fzd1、Lrp6、Tcf3、Tcf4这4个基因的mRNA相对表达量随着染毒剂量的升高而降低（P<0.001）,40mmol/L、60mmol/L剂量组中Fzd6、Lrp5、β-catenin、Lef1这4个基因mRNA相对表达量均降低（P<0.05）;2)Western blot结果显示,2,5-HD染毒24 h后,与对照组相比,40mmol/L、60mmol/L剂量组中β-catenin蛋白表达水平下降（P<0.05）,各剂量组中CCND1蛋白表达水平呈剂量依赖性下降（P<0.05）;3)细胞免疫荧光实验结果显示,2,5-HD染毒24 h后,与对照组相比,各剂量组中β-catenin在颗粒细胞核内的荧光表达强度均降低（P<0.05）,提示2,5-HD可抑制β-catenin核转位;4、2,5-HD染毒COV434细胞6h后,双荧光素报告基因检测的结果显示,与对照组相比,TOP/FOP的比值随着染毒剂量的升高而显著下降,即荧光素酶活性显著下降（P<0.05）,提示2,5-HD可导致β-catenin/TCF转录活性降低。结论:在本实验条件下,本研究得出以下结论:1、2,5-HD染毒后大鼠卵巢颗粒细胞miRNA和mRNA表达谱发生变化,提示2,5-HD致卵巢颗粒细胞损伤过程中,miRNA等表观遗传学调控机制可能参与其中。2、对miRNA-mRNA共表达网络中mRNA进行功能富集分析结果提示,2,5-HD染毒后可能通过miRNA介导卵巢颗粒细胞细胞周期和经典Wnt信号通路调控。3、2,5-HD体外染毒可导致卵巢颗粒细胞细胞周期阻滞于G0/G1期。4、2,5-HD可能通过诱导卵巢颗粒细胞Wnt/β-catenin通路抑制,抑制β-catenin的核转位,导致β-catenin/TCF转录活性降低,降低了该通路的代表靶点CCND1等基因的表达,进而诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。