本研究以红富士苹果继代试管苗叶片为试验材料,结合石蜡切片法对叶片离体培养下不定芽的形态发生进行了较系统的解剖观察,研究了不定芽的发生途径、分化时间及起源部位等,对叶片不定芽再生过程中一系列生理生化指标进行了测定,对比分析了光照培养和黑暗培养及培养基中细胞分裂素种类对各生理生化因子的影响,旨在探讨各因子在不定芽发生过程中的作用机制,以期为叶片再生不定芽调控提供理论依据;此外,试验还对影响叶片再生的主要因素即细胞分裂素种类及配比、暗培养时间、碳源、继代苗龄等多方面进行研究,以期建立并优化高效、稳定的红富士苹果离体叶片再生体系,从而为其遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1红富士苹果离体叶片不定芽起源及发育的研究结果表明:不定芽的发生过程是,叶片接种4d左右为细胞启动分化阶段,随后细胞加速分裂,培养7～10d时形成分生细胞团,培养到14d时形成不定芽原基,14d以后不定芽原基开始向完整的不定芽分化,培养到18～21d时不定芽形成,21d以后不定芽开始伸长生长;研究还发现红富士苹果离体叶片不定芽的起源部位主要是叶片表皮细胞和叶片维管束周围的维管束鞘细胞,属于多起源;发生途径具有多样性。2红富士苹果离体叶片不定芽再生过程中生理生化变化2.1内源激素含量及平衡的变化叶片细胞启动分化期需要较高含量的ZR、IAA和ABA,且暗培养下内源激素含量高于光培养的,细胞旺盛分裂期需要高含量的ZR和ABA及低含量的IAA;且暗培养下内源激素含量高于光培养的。不同外源细胞分裂素对内源激素变化的影响存在显著差异,TDZ诱导的叶片内源ZR和ABA含量显著高于BA诱导的,IAA的含量显著低于BA诱导的。内源ZR/IAA与ABA/IAA的比值均呈现先升高再降低、再升高-降低的趋势,且光下培养的比值低于暗培养的,TDZ诱导的比值高于BA诱导的。GA3的结果表明,其对叶片不定芽再生有负作用。综合分析,不定芽再生需要较高含量的ZR和ABA及一定量的IAA,同时细胞启动分化期和芽原基形成阶段高比值的ZR/IAA和ABA/IAA有利于不定芽的分化。2.2内源多胺含量及平衡的变化叶片离体培养过程中,内源多胺含量峰值均出现在培养前期,Put含量高峰出现在培养3d时,而Spm和Spd的高峰出现在培养7d时。光培养下的内源多胺含量显著低于暗培养下的,TDZ诱导的叶片内源多胺含量显著高于BA诱导的。结果表明,在叶片细胞启动分化期及不定芽原基诱导初期需要高含量的内源多胺,并且在不定芽分化时期内源多胺含量也一直维持在较高水平;同时各内源多胺之间的比值也是前期处于较高水平,但是比值之间的差异不明显。可见,不定芽再生需要较高含量的内源多胺,且内源多胺的平衡对不定芽的诱导有一定的影响。2.3酶活性的变化叶片离体培养过程中,在叶片培养初期及后期较高的SOD酶活性有利于叶片不定芽的分化及发育;在后期较高的POD酶活性有利于不定芽发育;培养前期较低水平的CAT酶活性有利于不定芽的诱导,培养后期较高的CAT酶活性有利于不定芽的形成;IOD酶活性变化比较复杂,且IOD活性与IAA含量密切相关。2.4 NO含量的变化叶片离体培养以后,叶片内NO含量明显提高。首先,叶片细胞启动分化期及细胞旺盛分裂期需要维持较高水平的NO含量,才能诱导不定芽原基的产生;其次,在培养后期也需要较高含量的NO才有利于不定芽的发育。在不定芽诱导过程中,光下培养的叶片NO含量显著低于暗培养的;TDZ诱导的叶片NO含量高于BA诱导的。3红富士苹果离体叶片高效再生不定芽体系的优化结果表明:较适宜叶片再生不定芽的生长调节剂为TDZ 6.0 mg/ L+NAA 0.1 mg/L,最适宜的暗培养时间为3周,最适宜的糖为蔗糖,最佳的继代苗龄为25d左右。在上述培养条件下红富士苹果离体叶片再生率达到100%,平均叶片再生芽数达到10.6个。另外,卡那霉素能显著抑制红富士苹果叶片不定芽再生,但因固化剂不同其抑制效果不同,在6.2 g/L琼脂做固化剂时,10 mg/L卡那霉素可完全抑制叶片再生,而在5.0 g/L Polygel的培养基上,卡那霉素50 mg/L才能完全抑制叶片再生。