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研究背景:乳腺癌（Breast cancer,BC）是女性最常见的恶性肿瘤之一,危害全世界女性的健康。最新发布癌症统计数据显示,女性乳腺癌新发病例超过226万例,其发病率（24.5%）和死亡率（15.5%）均为女性癌症首位。乳腺癌的病因受多种综合因素影响,除遗传、激素水平和饮食结构外,由于经济的发展和生活方式的改变,使得推迟生育、肥胖、缺乏运动和精神压力等也成为了患病的高危因素。尽管在早期诊断和治疗方案方面取得了进展,但中晚期和转移性乳腺癌患者的预后仍然较差。因此,深入了解乳腺癌发生发展机制,为乳腺癌临床治疗提供新的治疗靶点和分子预警标志物具有重要意义。葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基（Glucose-6-phosphatase catalytic subunit,G6PC）作为葡萄糖-6-磷酸酶的重要催化基团,在糖异生和糖原分解途径的最后一步催化葡萄糖6-磷酸（G6P）的水解,对调节葡萄糖稳态至关重要。研究表明,G6PC在多种肿瘤中异常表达,在肝细胞癌和肾癌等糖异生组织肿瘤中G6PC表达较低,并作为抑癌基因抑制癌症的发展;而在非糖异生组织肿瘤如卵巢癌、宫颈癌和胶质瘤中G6PC表达上调并发挥致癌作用,促进细胞增殖和侵袭性表型。G6PC发挥其复杂的代谢和非代谢作用,使其成为潜在的治疗靶点,除了在糖异生和糖原分解中的作用外,其在肿瘤中还有其他重要的生物学功能,值得进一步研究。目前,G6PC在乳腺癌中的作用尚不明确。研究目的:探究miR-494-3p/G6PC信号轴在乳腺癌恶性进展中涉及的生物学功能和相关分子机制:（1）评估G6PC在乳腺癌组织中的表达水平以及与患者临床病理特征之间的关系,明确G6PC在乳腺癌中的分子标志物作用;（2）探究G6PC对乳腺癌细胞增殖、转移、代谢和自噬等生物学功能的影响,寻找关键调控因子,并阐释相关分子机制;（3）揭示miR-494-3p与G6PC的靶向调控关系,探究miR-494-3p/G6PC/FOXO1信号轴调控乳腺癌恶性进展的分子机制。材料与方法:1.数据库分析及乳腺癌组织标本检测:1)Oncomine、Human Protein Atlas和Kaplan-Meier plotter等多种生信数据库分析G6PC在乳腺癌组织中的表达和预后情况;2)应用免疫组化和Western Blot实验检测G6PC在乳腺癌组织和细胞中的表达情况,并分析G6PC高表达与患者临床病理参数之间的关系。2.体外实验:1)应用慢病毒转染构建G6PC高表达和敲低的乳腺癌稳转细胞株;2)应用MTT、平板克隆和Ed U实验检测G6PC对乳腺癌细胞增殖能力的影响;3)应用流式细胞术和Western Blot实验观察G6PC对乳腺癌细胞周期分布的影响;4)应用划痕、Transwell、免疫荧光和Western Blot实验检测G6PC对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响;5)应用葡萄糖、乳酸和ATP试剂盒检测G6PC对乳腺癌细胞代谢水平的影响;6)应用透射电镜、Western Blot实验以及自噬抑制剂（3-MA/CQ）检测G6PC对乳腺癌细胞自噬水平的影响;7)应用数据库检索G6PC调控自噬的关键作用分子并通过免疫共沉淀和小分子干扰RNA（si RNA）回复实验检测G6PC与FOXO1的作用关系;8)应用数据库检索并预测靶向调控G6PC的miRNA,通过q RT-PCR和双荧光素酶报告基因实验验证二者靶向调控关系;9)应用数据库分析miR-494-3p在乳腺癌中的表达水平并预测相关生物学功能;10)通过转染miR-494-3p的模拟物和抑制物过表达或敲低miR-494-3p,应用平板克隆、流式细胞术、划痕、Transwell和Western Blot实验检测miR-494-3p/G6PC/FOXO1信号轴通过激活自噬促进乳腺癌恶性进展的分子机制。3.体内实验:1)构建裸鼠皮下移植瘤模型,比较差异表达G6PC对裸鼠移植瘤形成的影响;2)构建裸鼠尾静脉肺转移模型,比较差异表达G6PC对裸鼠肺转移形成的影响。结果:1.G6PC在乳腺癌中的分子标志物作用:生信分析和免疫组化结果显示G6PC在乳腺癌组织中高表达,且其高表达与患者的不良预后密切相关:G6PC高表达与乳腺癌患者的总生存期缩短有关,且与病理学分级三级的患者和淋巴结转移的患者的预后不良有关;临床病理学参数分析显示,G6PC高表达与患者组织学分级和淋巴结转移密切相关。2.G6PC调控乳腺癌恶性生物学进程:1)通过MTT、平板克隆和Ed U实验发现,沉默G6PC可抑制乳腺癌细胞的细胞活性、克隆形成和DNA合成能力,G6PC高表达则作用相反;裸鼠移植瘤模型显示G6PC高表达裸鼠肿瘤的体积和重量明显增加,反之亦然;2)流式细胞术结果显示,沉默G6PC可阻滞乳腺癌细胞于G0/G1期,且下调G0/G1期检查点标志物CDK6、Cyclin D1的表达;G6PC高表达时则促进细胞周期进程;3)通过划痕和Transwell实验发现,G6PC高表达可明显促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭,免疫荧光和Western Blot实验结果显示G6PC高表达影响EMT相关标志物的表达,促进上皮-间质转化进程;裸鼠肺转移模型显示G6PC高表达增加了裸鼠的肺转移灶数目,反之亦然;4)通过KEGG数据库和GSEA分析发现G6PC与自噬调节相关;透射电镜和Western Blot结果显示G6PC高表达可通过ERK信号通路促进乳腺癌细胞的自噬水平,且加入自噬抑制剂后发现G6PC介导的自噬在乳腺癌中发挥促癌作用;5)通过STRING数据库检索发现FOXO1可能是G6PC调控自噬的关键效应分子,CO-IP实验证实G6PC与FOXO1存在相互作用关系;功能回复实验显示沉默FOXO1可以阻断G6PC对乳腺癌细胞自噬、增殖和转移的促进作用。3.miR-494-3p/G6PC/FOXO1通过自噬调控乳腺癌的恶性进展:1)生信分析预测靶向调控G6PC的miR-494-3p,且高表达miR-494-3p可显著抑制G6PC的表达水平;2)双荧光素酶报告基因实验显示miR-494-3p结合G6PC的3’UTR区靶向调控G6PC的表达;3)数据库检索发现miR-494-3p在乳腺癌组织中低表达,且与乳腺癌患者的临床分期和淋巴结转移呈负相关;4)细胞功能实验结果表明G6PC可逆转miR-494-3p抑制乳腺癌细胞自噬、增殖和转移,以及FOXO1和相关标志物的表达。结论:G6PC在乳腺癌中高表达并预示患者不良预后,miR-494-3p/G6PC信号轴通过调控自噬促进乳腺癌的恶性进展。