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卤代醌类化合物是环境中广泛存在的一类持久有机污染物,它们主要由多卤代芳香族化合物通过化学反应、酶促反应以及生物体内代谢等多种途径脱卤形成,在以上过程中形成了大量中间产物,这些中间产物多具有细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、免疫毒性等多种毒性效应,严重威胁着人类健康。本课题分为两个部分,从体内和体外水平揭示卤代醌类化合物的毒性机制,为完善卤代醌类化合物毒性机制提供新的内容,为卤代醌类化合物引起疾病的预防和治疗提供新的思路。第一部分：姜黄素拮抗四氯苯醌诱导小鼠肝损伤的机制研究四氯苯醌(TCBQ)由广泛应用的木材防腐剂五氯酚(PCP)代谢产生,代谢过程发生氧化还原反应,并由此产生大量的活性氧(ROS),从而造成机体氧化损伤。肝脏是人体主要的代谢与解毒器官,TCBQ在体内代谢可能会造成肝脏损伤。姜黄素(Curcumin)是从姜黄根茎中提取的一种天然多酚产物,具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理作用。它抗氧化与清除自由基的作用能够保护机体免受氧化应激的损伤。同时,在本实验中我们研究了姜黄素拮抗四氯苯醌诱导小鼠急性肝损伤的作用机制。本实验利用四氯苯醌(TCBQ)建立小鼠急性肝损伤模型,我们把32只昆明小鼠随机分为四组,每组8只：对照组、姜黄素组、TCBQ组和TCBQ+姜黄素组。对照组小鼠给予等量的溶剂,姜黄素组小鼠连续5天给予姜黄素,TCBQ组小鼠给予单剂量的TCBQ, TCBQ+姜黄素组小鼠连续5天腹腔注射给予姜黄素,在最后一次给予姜黄素3小时后腹腔注射给予TCBQ,24小时后取小鼠血清及肝脏检测肝脏损伤相关指标。我们在血清中检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,在肝脏中检测TBARS、SOD、CAT水平。这些结果显示四氯苯醌对小鼠肝脏造成了严重的损伤。HE染色观察肝脏病理学变化,结果显示TCBQ组中有大量的炎症细胞浸润,说明在这肝脏中存在炎症反应。iNOS、COX-2免疫组化和p65、TNF-α、IL-6、IL-β、IκB、P-IκB Western blot结果进一步证明了四氯苯醌诱导的肝损伤主要为炎症反应。我们进一步考察了凋亡相关蛋白Bax、 Bc1-2、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的表达,发现TCBQ组中这些蛋白的表达与其它组相比没有明显变化。Cleaved Caspase 3免疫组化结果也无明显变化。这表明四氯苯醌不引起肝细胞凋亡有研究表明,姜黄素的保护作用归因于它清除自由基的能力,因此,我们选取重要的抗氧化信号通路Nrf2/Keap1/ARE作为研究对象。实验结果显示姜黄素激活了Nrf2/Keap1/ARE信号通路,对四氯苯醌诱导的急性肝损伤发挥了较好的拮抗作用。以上研究表明四氯苯醌诱导的急性肝损伤主要为炎症反应,但不引起肝细胞凋亡。姜黄素通过激活Nrf2/Keap1/ARE信号通路,调节Ⅱ相代谢酶HO-1、NQO1在肝组织的表达,从而达到保护肝脏的作用。第二部分：多氯联苯醌通过内质网应激途径诱导HepG2田胞凋亡的机制分析多氯联苯醌(PCBQ)是氯代芳香族化合物多氯联苯(PCBs)的主要代谢产物。近年有研究报道,PCBs代谢产物可以诱导机体产生氧化应激反应,进而造成氧化损伤。而氧化应激反应、内质网应激反应和凋亡有密切联系,这就提示我们多氯联苯醌可能引起内质网应激反应及凋亡。本实验选用人肝癌HepG2细胞作为研究对象,以考察多氯联苯醌是否能够在HepG2细胞中诱导内质网应激反应及凋亡的发生。首先,在荧光显微镜和透射电镜下观察HepG2细胞及其内质网在未加PCB29-pQ与加入10 μM PCB29-pQ处理48 h后的形态变化,结果发现在给药组细胞中出现了凋亡及内质网应激的典型特征。然后从浓度梯度和时间梯度上分别考察PCB29-pQ诱导内质网应激相关蛋白的表达情况,并用RT-PCR分析基因Bip、GRP94、XBP-1的mRNA表达水平。与对照组相比,PCB29-pQ处理的细胞相应蛋白和基因的表达量均有明显提高。用流式细胞仪检测PCB29-pQ引起细胞内钙水平的变化。实验结果表明PCB29-pQ能够提高细胞内钙水平。这些结果说明了PCB29-pQ能够诱导HepG2细胞发生内质网应激。在形态学考察中发现PCB29-pQ处理的细胞有明显的凋亡现象,因此,我们根据文献报道选取了内质网应激反应中三条参与凋亡调控的信号通路：PERK/eIF2α/ATF4/CHOP、Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3和IRE1α/JNK/c-Jun进行研究。一系列实验结果证明,PCB29-pQ通过激活PERK/eIF2a/ATF4/CHOP、Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3信号通路诱导HepG2细胞凋亡。接着用加入钙离子螯合剂BAPTA-AM和ROS清除剂NAC的方法以考察PCB29-pQ引起内质网应激的原因。结果表明,PCB29-pQ引起的内质网应激受细胞内钙离子和ROS水平的调节。根据以上研究可知,PCB29-pQ能够诱导HepG2细胞发生内质网应激,并受细胞内钙离子浓度和ROS水平的调节。PCB29-pQ引起的凋亡受PERK/eIF2a/ATF4/CHOP和Caspase 12/Caspase 9/Caspase 3信号通路的调控,而IRE1α/JNK/c-Jun通路在本实验中没有被激活,未参与PCB29-pQ引起的细胞凋亡。