目的：蛋白质工程产生于20世纪80年代，其实施策略有两种：以定点突变为代表的理性设计和以定向进化为代表的非理性设计。理性设计是蛋白质改造的基本技术，其中，最关键的问题是弄清酶蛋白分子结构与功能之间的关系，有目标的选取突变位点对其进行改造。同时，突变位点的选择也是酶蛋白改造的关键选择，通常需要蛋白分子结构与功能相关方面的信息积累。但对于某些缺乏研究积累的蛋白性质的改造，如蛋白分子的蛋白酶抗性改造，对于理性设计所需要的突变位点，通常无法用理性设计方法来获得，可以说这是一项十分有挑战性和重要应用价值的工作。饲料用酶是一类用量十分巨大的工业用酶，因其在加工使用过程中的特殊性，所以对酶的热稳定性、酸稳定性，蛋白酶抗性以及酶促反应的宽pH范围等都有较高的要求。饲料用酶是在进入养殖动物消化道之后发挥作用的，在消化道中的蛋白酶对饲用酶的分解是影响饲用酶使用效率的重要原因，所以，具有蛋白酶抗性是饲用酶十分重要的性质。本研究结合实验室已经建立的基于生物催化与计算化学的蛋白分子蛋白酶抗性理性设计的方法，进行Bacillus subtilis168β-1,4-内切木聚糖酶胰蛋白酶抗性的改良，以获得胰蛋白酶抗性提高的改良酶，同时再次验证所建立的胰蛋白酶抗性理性改良方法的可行性。方法：（1）通过Discovery Studio3.0软件获得优化后的木聚糖酶的三维结构和结构中所有胰蛋白酶水解位点及暴露程度。（2）根据胰蛋白酶水解位点的暴露程度和通过比较突变效应能量值筛选出突变后结构与野生型相近或是比野生型还稳定的突变体。（3）对突变后的三维结构进行分子动力学模拟，计算表征结构稳定性的参数RMSD值，并且由动力学评价得到的三个突变体的最低能量构象与野生型最低能量构象进行结构相似性评价，进一步确证突变氨基酸的组合类型。（4）利用重叠延伸PCR定点突变技术对XynA野生型基因进行突变，PCR产物与@-@@a载体连接，在大肠杆菌DH5α中扩增后，阳性克隆测序，验证正确的重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。（5）对纯化后的改良酶进行酶学性质分析，并且将酶液经人工肠液（pH6.810mg/mL胰蛋白酶溶液）处理，分析评价野生型及其突变体在胰蛋白酶溶液中的稳定性。结果：最终选取**、**进行单点突变，**/**进行两点突变，其中，位于酶蛋白内部的氨基酸位点**作为反证位点。对突变体及野生型进行酶学性质分析发现，突变体与野生型的最适pH都是6.0，在pH4.0-9.0范围内，突变体XynA、XynA**和XynA**/**的pH稳定性比野生型更宽泛，XynA**的pH稳定性与野生型相似。XynA、 XynA**和XynA**/**的最适反应温度为60℃，在50℃以下较稳定，55℃时的半衰期是40min。XynA**的最适温度为40℃，与野生型相比也发生了改变。其温度稳定性较野生型差，当温度高于40℃时，酶失活的速度明显加快。XynA**在40℃以下较稳定，45℃时的半衰期是40min。在用人工肠液（pH6.810mg/mL胰蛋白酶溶液）处理野生型及其突变体的过程中发现，两点突变体XynA**/**和单点突变体XynA**的残留酶活力均明显比野生型XynA和内部对照突变体XynA**高。单点突变体XynA**的半衰期是193min，是野生型的1.52倍，两点突变体XynA**/**在人工肠液中的稳定性有了明显的提高，其半衰期是257min，是野生型XynA的2.02倍，是单点突变体XynA**的1.33倍。XynA**在人工肠液中40℃处理不同时间测活，XynA**在胰蛋白酶溶液中的半衰期为90min，仅比野生型酶缩短了37min。