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目的:研究葛根素对小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化的影响以及TRPM3在其中的作用,为临床应用葛根素治疗骨质疏松以及葛根素在临床上的进一步开发利用提供理论指导。方法:1.不同浓度(0.1,1,10μM)的葛根素作用于成骨细胞24,48和72h后,CCK-8法检测空白对照组、葛根素组以及阳性对照雌二醇组细胞的活性。2.0.1,1,10μM葛根素作用成骨细胞48h后,流式细胞术检测空白对照组、葛根素组以及雌二醇组细胞的细胞周期。3.碱性磷酸酶(ALP)活性检测0.1μM葛根素和0.01μM雌二醇作用48h后成骨细胞分化能力的改变。4.茜素红钙结节染色法检测0.1μM葛根素和0.01μM雌二醇干预14,21和28d后各组细胞的矿化能力。5.RT-PCR和Western Blotting检测0.1 μM葛根素和0.01μM雌二醇作用细胞48h后,TRPM3mRNA和蛋白质的表达水平。6.流式细胞术和钙离子检测试剂盒分别检测0.1μM葛根素作用2,24和48h后,细胞内、外钙离子的浓度。7.转染TRPM3-siRNA、使用TRPM3激动剂孕烯醇酮硫酸盐(pregnenolone sulfate,PS)、TRPM3抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)作用 MC3T3-E1 细胞后,检测 Runx2表达水平以及成骨细胞增殖、分化和矿化能力的改变。结果:1.0.1,1,10μM葛根素能显著促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖,使G1期细胞比例减少,G2+S期细胞比例增加,其中以0.1μM的浓度作用效果最佳。与空白对照组相比较,0.1μM葛根素能显著提高细胞ALP活性,促进矿化结节的形成。2.0.1μM葛根素作用细胞48h后,TRPM3表达水平降低,而Runx2的表达水平升高。3.TRPM3-siRNA和2-APB作用细胞48h后能够促进Runx2的表达,从而促进成骨细胞增殖分化,而PS则抑制此作用。4.向细胞培养液中加入不同浓度(0.5,5,10,20mM)的钙离子,分别培养24,36和48h,与空白对照组相比较,钙离子组的细胞活性和ALP活性显著增强。5.葛根素作用细胞2h后,细胞内的钙离子浓度增加,细胞外钙离子浓度减少;作用24h时,与空白对照组相比较,葛根素组细胞内、外钙离子浓度的差异没有统计学意义。当作用时间延长至48h时,表现为葛根素组细胞内钙离子浓度降低,细胞外钙离子浓度升高。结论:葛根素能够促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖,分化和矿化,原因可能为:①葛根素通过下调TRPM3表达导致Runx2的表达增强,从而促进成骨细胞增殖和分化;②葛根素短时间(2h)内能使细胞内的钙离子浓度增加,细胞外钙离子浓度减少,促进细胞的增殖和分化;长时间(48h)作用后,TRPM3的表达量下降,使渗透到细胞内的钙离子减少,导致细胞外间隙的钙离子浓度增加,这可能是为了增加与细胞外基质蛋白的结合,为矿化做准备。