研究背景及存在的科学问题昆虫的变态类型分为完全变态和不完全变态,我们所研究的重要农业害虫棉铃虫属于完全变态类昆虫的一种,其组织形态变化极为显著,在昆虫生长发育过程中,蜕皮激素（20E）和胰岛素样肽（ILPs）发挥着重要作用。昆虫的20E信号途径和胰岛素insulin/胰岛素样生长因子信号（IIS）途径（简称胰岛素途径）存在拮抗作用。类固醇激素20E启动昆虫的蜕皮和变态,20E进入细胞内可以与其核受体EcR结合起始下游基因的转录,起始20E的基因组途径。目前研究发现,类固醇激素可以结合细胞膜上的受体起始某些非基因组途径如蛋白质快速修饰,Ca2+水平的快速变化等快速的细胞效应。且在哺乳动物、家蚕、果蝇中已经得到证实。细胞膜上的G蛋白偶联受体（GPCR）属于7次跨膜结构的蛋白家族,在细胞膜上转导包括神经递质,激素等各种信号。人体内有多个GPCRs,是人类中最庞大的膜蛋白家族。已有研究发现在昆虫体内也存在多个GPCRs,我们实验室已经发现有多个GPCRs参与20E的信号转导过程,多个GPCRs共同参与同一配体20E的信号转导,其机制尚未阐明。胰岛素受体（INSR）结合胰岛素来促进幼虫生长和维持正常的血淋巴葡萄糖水平,虽然已知类固醇激素如雌激素和20E均会拮抗胰岛素的功能,但导致这种拮抗作用的分子机制仍不清楚。此外,胰岛素途径的改变会导致糖尿病的发生,胰岛素能维持正常血糖水平而类固醇激素会拮抗胰岛素的功能增加血糖,甚至诱发糖尿病,然而这些机制还没有完全阐明。研究结果在棉铃虫基因组中鉴定了 122个基因编码经典的GPCRs,并对它们进行分类,基因组中未注释分类的GPCRs也进行了重新归类。分析了幼虫中肠转录组中变态期较取食期差异表达的GPCRs,并从中检查了变态期上调表达的1 1个GPCRs及2个下调表达的GPCRs的表达谱,发现它们在虫体的各组织和发育阶段中的表达具有很大差异。进一步证实了 6个GPCRs参与类固醇激素20E信号通路,通过RNA干扰（RNAi）敲降这些GPCRs,幼虫出现不同的表型及延迟化蛹或化小蛹等。敲降这些GPCRs会降低20E信号通路下游基因HHR3的表达,但只有敲降GPCR-催乳素释放肽受体（PrRPR）和Smoothened（Smo）才会导致在20E调控变态过程中起作用的双功能磷酸酶（Pten）和转录因子Forkhead box O（FoxO）的表达下降,敲降PrRPR和Smo同时降低了转录因子BrZ7的表达水平,敲降脂动激素受体Akhr和5-羟色胺受体Htr上调转录因子Krüppel homolog 1（Kr-h1）的表达,敲降以上这四个GPCR后均导致化蛹延迟。敲降Frizzled 7（Fzd7）下调Wnt及cMyc的表达水平,导致化蛹体重减轻,敲降速激肽受体TkR86C没有引起表型的差异变化。通过20E酶联免疫检测（20E-EIA）方法证实了 PRRPR可以结合20E。这些结果解释了多个GPCRs通过不同的表达谱以及对不同基因表达的调控来传递20E信号的机制。20E诱导INSR去磷酸化以拮抗胰岛素信号途径的功能。我们观察到INSR在幼虫取食期表达量及磷酸化水平均较高,但在蜕皮变态期其表达量和磷酸化水平较低。胰岛素使INSR的表达及磷酸化水平均上调,而高滴度的20E则使INSR的表达下调并且诱导了INSR的去磷酸化。20E能上调蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B,由Ptpn1编码）的表达,使INSR去磷酸化。同时,20E上调PTEN表达,维持转录因子FoxO的核定位,定位于细胞核的FoxO促进Ptpn1的表达并抑制Insr的表达。采用RNA干扰技术敲降Ptpn1维持了 INSR的磷酸化,并增加了 20E滴度导致虫体提前化蛹并化小蛹。而敲降Insr抑制了幼虫的生长,减少了 20E的产生导致延迟化蛹并化小蛹,敲降Insr还导致血淋巴葡萄糖的积累。综上所述,这些结果表明,20E通过去磷酸化INSR拮抗胰岛素途径,阻止幼虫生长,积累血淋巴葡萄糖。结论及科学意义1.本论文鉴定了棉铃虫基因组中的全部经典GPCR,并进行归类,对棉铃虫GPCR的研究提供了参考,并发现了 20E的另一个受体PRRPR。20E可以通过结合PRRPR或不结合20E的SMO调控Pten和FoxO的表达。以及20E还可以通过其他的GPCR调控其他基因的表达。这进一步揭示了多个GPCRs通过组织差异表达和调控不同基因表达来传递20E信号,为类固醇激素信号途径的研究提供新的理论依据,为害虫防治提供新的GPCR靶标。2.胰岛素促进幼虫生长,并在幼虫取食阶段促使20E达到临界滴度,临界滴度的20E上调PTEN的表达,使FoxO定位于细胞核中,核定位的FoxO上调磷酸酶PTP1B的表达,使INSR去磷酸化,同时FoxO抑制INSR的表达,从而拮抗胰岛素途径。临界滴度的20E阻止幼虫生长,启动变态过程,诱导血淋巴葡萄糖的积累。这为进一步研究类固醇激素与胰岛素之间的相互作用提供新的思路和依据,为害虫防治提供了新的靶标,同时为血糖代谢的研究提供理论知识,也可以为人类糖尿病的研究提供新的实验模型。