一、研究背景和目的继2000年我国首例播散性毛孢子菌病病例报道以来,播散性毛孢子菌病愈来愈受到广泛重视。该病是一种广泛累及皮肤、肝、脾、肺、肾等器官的系统性真菌病,主要致病菌为阿萨希毛孢子菌。患者多因病情复杂、多器官受累、诊断不明和(或)治疗不及时而死亡。由于该病的临床表现缺乏特异性,其诊断在很大程度上要依靠准确、特异的辅助检查。传统辅助手段包括病原菌培养、鉴定及组织病理检查等,耗时长,至少需1周以上时间,不仅影响该病的早期诊断和及时治疗,也因为临床上缺乏特异、快速的检诊手段及对该病的认识不足而易造成误诊误治。目前,非培养诊断技术如真菌成份及代谢产物测定、特异性DNA片段扩增等以其灵敏、快速等优点而日益受到关注。真菌的结构由细胞壁、隔膜、细胞膜及有关细胞器构成,这些结构的组成成份及其代谢产物在真菌的生成和繁殖过程中,含量及活性也会有相应的变化。(1,3)-β-D-葡聚糖是真菌胞壁的重要组成成分之一,仅在深部真菌感染后经吞噬细胞吞噬后该成分释放入血,而在浅部真菌感染时并不释放,因此对播散性真菌感染的诊断有重要价值。分子生物学方法因其具有较高的敏感度和特异度,近来在深部真菌感染早期诊断中也倍受关注。常用的基本的方法包括核酸杂交及扩增技术和巢式PCR等技术等。本研究在建立播散性阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)感染模型的基础上,分别对比观察了肺泡灌洗液、尿液及血浆的(1,3)-β-D-葡聚糖的含量,同时采用巢式PCR方法检测三种体液标本中T.asahii DNA片段,并与真菌培养方法进行比较,试图从血液之外的其它一些体液中获得新的、具有诊断意义的标本,同时进一步评价(1,3)-β-D-葡聚糖检测和巢式PCR方法在播散性T.asahii病早期诊断、预后判断方面的意义,为研究T.asahii的致病机理、病程进展及治疗前景提供重要依据。二、方法和结果1.建立阿萨希毛孢子菌感染动物模型Wistar雄性大白鼠45只,随机分为三组实验A组、实验B组和对照组(C组),每组15只。实验开始第0天,实验A组和B组大鼠分别尾静脉接种12×10~7CFU/ml浓度T.asahii孢子悬液0.8ml,对照组尾静脉注射等量生理盐水。实验A组在接种第10天后处死,实验B组及对照C组在接种第20天后处死。分别采集三组动物的肺泡灌洗液、尿液及血浆,一部分作真菌培养,另一部分采用G试验检测三种标本中(1,3)-β-D-葡聚糖含量,用巢式PCR检测体液标本中T.asahii特异性DNA片段。同时采集每只动物模型的肝、肺、肾组织,一部分经10%甲醛固定、包埋、切片、HE、GMS和PAS染色制片,另一部分制成匀浆送培养。2.真菌培养结果组织培养阳性率为2%,血浆真菌培养阳性率为3.33%,支气管肺泡灌洗液及尿液真菌培养均为阴性。3.(1,3)-β-D-葡聚糖检测结果感染动物模型血浆、支气管肺泡灌洗液、尿液标本G试验平均敏感性分别为76.67%、80.00%、和10%,其中血浆、支气管肺泡灌洗液标本G试验结果与对照组有显著差异(P＜0.001),尿液标本测试结果无统计学意义;组织培养阳性数较多的动物其血浆标本(1,3)-β-D-葡聚糖浓度较其它标本高,即(1,3)-β-D-葡聚糖浓度与组织脏器感染数量之间存在正相关,二者存在线性关系,为高度相关(|r|＞0.7,P≤0.05);感染10d时三种标本(1,3)-β-D-葡聚糖平均浓度到达峰值,血浆为54.565 pg/ml,支气管肺泡灌洗液为24.508 pg/ml,尿液13.117pg/ml,浓度与感染时间成正比。20d后各标本(1,3)-β-D-葡聚糖浓度下降,血浆为27.077 pg/ml;支气管肺泡灌洗液浓度为21.339 pg/ml;尿液为11.748pg/ml,此时浓度与感染时间成反比。4.巢式PCR方法检测结果30只实验动物血浆标本巢式PCR平均敏感性为66.67%,支气管肺泡灌洗液标本平均阳性率为43.33%,尿液标本为20.00%。其中血浆、支气管肺泡灌洗液标本敏感性与对照组比较有显著差异(P＜0.001),尿液标本检测结果与对照组相比提示有差异(0.001＜P＜0.05)。血浆、支气管肺泡灌洗液巢式PCR方法的阳性率与血培养和灌洗液培养结果比较经配对卡方检验,有显著统计学差异(P＜0.005)。5.G试验结果与巢式PCR方法和真菌培养法结果的对比30只实验动物血浆标本巢式PCR平均阳性率为66.67%、G试验为76.67%、真菌培养为3.33%,其中G试验阳性率与血培养结果经配对卡方检验,二者之间存在显著差异(X=21.04,P=0.0000且b＞c),巢式PCR方法的阳性率与血培养比亦有显著统计学差异(X~1=17.05,P~1=0.0005且b＞c);血浆G试验阳性率虽然略高于巢式PCR方法,但两者无统计学差异(P＞0.05)。支气管肺泡灌洗液培养全部为阴性;支气管肺泡灌洗液标本巢式PCR方法平均阳性率为43.33%,G试验为80.00%,巢式PCR方法和G试验结果均与灌洗液真菌培养有显著差异(P＜0.005),同时两种检测方法者之间的阳性率也存在统计学差异(X~2=9.60,P~2=0.0019)。三、结论1.与真菌培养相比,G试验和巢式PCR均具有较高敏感性:对照组三种体液标本G试验检测均为阴性,提示该试验假阳性率低、特异性较高。与血培养方法相比(1,3)-β-D-葡聚糖检测具有阳性率高、采血量少(0.5-1 ml)等优点,因而更容易被患者接受。本实验首次对支气管肺泡灌洗液和尿液标本中的(1,3)-β-D-葡聚糖进行了观察,结果发现支气管肺泡灌洗液标本G试验平均敏感性为80%,较其它标本略高。分析原因,一方面肺部是T.asahii的易感部位,另一方面肺泡中存在的大量吞噬细胞,吞噬病原菌后可能释放更多的(1,3)-β-D-葡聚糖,这一特性为该疾病的临床诊断提供了一条新的途经。尿液标本中G试验敏感性较低,仅为10.00%,且多见于感染脏器数量较多的动物,所以在尿液中检测到(1,3)-β-D-葡聚糖,提示感染可能较为严重和广泛。巢式PCR方法亦在血浆、支气管灌洗液和尿液标本的检测中有良好表现,检测结果显示实验A、B两组血浆、支气管肺泡灌洗液标本的巢式PCR结果与对照组相比均有显著差异,这些数据说明巢式PCR方法在检测播散性T.asahii感染方面具有较高的敏感性和特异性。实验中血浆标本巢式PCR方法的敏感性显得尤为突出,更具有临床应用价值2.G试验和巢式PER方法各有特点:虽然G试验和巢式PCR扩增均有较高的敏感性和特异性,但二者各有其特点。巢式PCR扩增适合于播散性毛孢子菌病菌血症,而在没有菌血症形成的情况下,G试验则仍具有检测意义。因为G试验并非如巢式PCR法一样以菌体DNA片段为目标,而是检测真菌被吞噬后所释放的(1,3)-β-D-葡聚糖成分。实验动物静脉接种菌液后短期内形成菌血症,此时标本经巢式PCR检测,阳性率很高;一段时间后,大部分菌体被血液中的白细胞吞噬、代谢,血液中完整的真菌菌体逐渐变少甚至消失,其DNA被分解破坏,使得血浆巢式PCR方法阳性率降低。而未被吞噬的真菌被循环血液带到各脏器并逐渐繁殖,再次经组织中的噬细胞所吞噬,(1,3)-β-D-葡聚糖成份释放入血,恰好被G试验所检测到,使得该阶段血浆G试验的阳性率略高于巢式PCR,所以G试验的可应用时间更长。然而G试验只能提示深部真菌感染的存在,不能确定是否为毛孢子菌,而菌种的分类恰恰是巢式PCR方法的优势所在。3.(1,3)-β-D-葡聚糖检测有助于判断感染的范围:(1,3)-β-D-葡聚糖的浓度与组织脏器感染数量之间存在正相关,即(1,3)-β-D-葡聚糖浓度越高,组织器官感染的数量越多。经组织病理切片证实,(1,3)-β-D-葡聚糖浓度值越高的大鼠,病理组织切片上亦显示越多的微脓疡和组织破坏。值得一提的是,虽然组织培养总阳性率较低,但其中肾脏组织培养的阳性率相对较高,这一点与国外报道中肾脏中T.asahii毛孢子菌的清除率最低相吻合,因此对肾脏的观察应引起今后研究的重视。4.(1,3)-β-D-葡聚糖检测有助于判断感染的转归:(1,3)-β-D-葡聚糖检测有助于判断感染的转归感染的不同时期(1,3)-β-D-葡聚糖浓度亦有相应的变化。接种初期在免疫抑制的条件下真菌大量繁殖,(1,3)-β-D-葡聚糖释放量急剧上升,10d后随着机体免疫力逐渐恢复,吞噬细胞对病原菌的吞噬能力逐渐增强,真菌在血液循环中的数量迅速减少,但由于感染组织中葡聚糖的释放在一定程度上弥补了血浆本身(1,3)-β-D-葡聚糖释放的减少,使得(1,3)-β-D-葡聚糖浓度呈缓慢下降的趋势。实验观察发现,真菌接种两周后,大鼠饮食、活动和反应能力显著好转,与(1,3)-β-D-葡聚糖浓度改变一致。所以,动态观察(1,3)-β-D-葡聚糖对判断感染的转归有一定的帮助。本研究中(1,3)-β-D-葡聚糖测定及巢式PCR方法,虽然具备真菌培养、病理检查等传统辅助诊断方法所不具备的优点,但其检测结果仍需结合临床,进行综合分析。本研究虽然在动物实验中取得了初步成果,但仍需加强其可重复性及准确性,以便逐步完善,在实际临床中得以推广应用。