论文部分内容阅读
目的:湖北钉螺是日本血吸虫唯一中间宿主,在血吸虫病传播过程中起关键作用。湖北钉螺微卫星DNA库建立之后,为后续微卫星位点的筛选提供了丰富的储存库,但库中的位点却未被充分利用。因此,本文利用生物信息学方法筛选多态性的微卫星位点,设计并合成相应的引物,为后续的群体遗传学分析提供有效的分子标志。湖北钉螺的地理分布与日本血吸虫病的流行区具有严格的一致性,主要分布在我国的长江流域以及南部地区。受到分布范围广、地理隔离以及滋生环境复杂等因素的影响,不同地理群体的湖北钉螺发生了明显的分化和变异。因此,本研究通过对不同地区的湖北钉螺进行群体遗传学研究,以期找出遗传变异的规律,为低流行水平状态下评价湖北钉螺控制措施效果和监测钉螺扩散提供科学依据。方法:从公共数据库(Genbank)中下载湖北钉螺的核苷酸序列,使用SciRoKo3.3软件查找微卫星序列,从中挑选微卫星位点(以3核苷酸重复片段为主),同时从已发表文献中挑取多态性的微卫星位点。然后,利用软件Primer premier和Oligo来进行引物的设计和评价,并外送合成。鉴定引物扩增的效果,最终构建扩增效果较好的多重反应体系1。从安徽石台、和县、枞阳和江苏横塘、太仓5个地区采集湖北钉螺样本,进行钉螺DNA提取。结合文献报道的另4对微卫星引物(即T1-10、T4-25、T4-22和D11,多重反应体系2),采用9对STR(2个多重反应体系)进行PCR扩增,扩增产物外送测序检测。采用GenAIEx 6.5、Structure2.2、Bottleneck、MEGA、DIYABC等软件分析数据,分析所应用微卫星位点的多态性、湖北钉螺的种群内遗传多样性、种群间遗传分化、种群结构、瓶颈效应、种系进化树以及推断种群进化历史等。结果:从湖北钉螺微卫星DNA库以及已发表的文献中筛选并最终鉴定了5对微卫星引物的多态性,多态信息含量(PIC)分别为0.861、0.889、0.87、0.86和0.911,平均为0.878,全部高于0.50,表明这5对引物具有高度多态性。并构建了1个多重反应体系,为后续种群遗传学研究提供有效的工具。采用2个多重反应体系9对STR引物,对150只湖北钉螺进行PCR扩增,有146只钉螺成功分型,成功分型率达97.3%。9个微卫星位点在5个群体中共检测到251个等位基因,范围为17(T1-10)~46(T4-25),平均为27.889,表明各位点的扩增效果均较好。各微卫星位点的PIC范围为0.810(T1-10)~0.947(B14和T4-25),平均为0.905,显示本研究所采用的9个微卫星位点均为高度多态性位点。钉螺群体多样性:等位基因数Na在4.556(太仓)~16.222(枞阳)之间,平均11.689。有效等位基因数Ne在2.866(太仓)~10.849(和县、枞阳)之间,平均6.964。安徽3个种群多样性较高,而江苏2个种群多样性较低。Hardy-Weinberg平衡检测发现不符合哈-温平衡,所检测45组数据中(5个群体×9个位点),有32个显著偏离Hardy-Weinberg平衡。其中,江苏横塘种群在所有位点均偏离HWE(P<0.05)。AMOVA结果显示,种群间、个体间以及个体内的变异分别占总变异的15%、47%和38%,且均具有统计学意义,即说明5个群体中,至少有2个群体之间存在显著的遗传差异。5个地区的湖北钉螺群体之间存在中等程度的遗传分化。群体结构、主成分以及种系进化树分析,三种方法结果一致,即安徽和县和安徽枞阳这两个群体聚在一起,其余3个群体各自分开。DIYABC分析运用logistic回归方法得到场景1(顺序进化)后验概率为0.5523,可信区间为[0.3490,0.7555];场景2(混合进化)后验概率为0.4477,可信区间为[0.2445,0.6510]。在1000次模拟运算中,其中543次结果为场景1,457次结果为场景2。所以,场景1最可能是本研究5个地区的进化模型,即湖北钉螺的进化是沿着长江流域自上而下逐步扩散的。结论:1.设计合成了DH01和DH02(3-核苷酸重复片段),优化合成B14、C22和T6-17(2-核苷酸重复片段),并对每个位点进行多态性评价;构建了多重反应体系1,包括5对微卫星引物(B14、DH01、C22、DH02、T6-17);2.结合另4对微卫星引物,本研究共应用9对微卫星引物对湖北钉螺不同地区标本进行分子生物学分析,发现:1)安徽3个种群多样性较高,而江苏2个种群多样性较低,这可能与历史疫情、钉螺孳生环境等有关;2)湖北钉螺群体之间存在中等程度遗传分化,其中江苏横塘与江苏太仓群体之间遗传分化程度最大;3)安徽和县和安徽枞阳这两个群体聚在一起,与其余3个群体各自分开,这可能与这两群体均处于长江边,同属于湖区环境,且距离较近有关;4)江苏横塘和安徽石台这2个群体未经历瓶颈效应(p>0.05),其余3个群体均经历了瓶颈效应(p<0.05);5)湖北钉螺的进化顺序是沿着长江流域从上而下进化,且没有混合进化。