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火绒草是一种广泛应用于民间治疗咳嗽、肾炎、尿道炎等炎症疾病的中草药,为深入研究火绒草抗炎作用,本课题首先用MTT实验及一氧化氮(NO)实验对火绒草提取物细胞毒性及抗炎活性进行初筛,筛选得到抗炎活性高且细胞毒性小的火绒草提取物ent-kaur-15-en-17-al-18-oicacid(LL-3),课题进一步探究其抗炎作用及机制,实验结果发现LL-3通过减少氧化性物质活性氧(ROS)及丙二醛(MDA)生成,提高还原性物质谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)活力减少氧化应激的产生。RT-PCR实验结果发现LL-3能显著降低环氧合酶-2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤死亡受体因子-α(TNF-α)促炎介质及因子过表达,为进一步探究其信号通路,Western blot实验检测P38、p-P38、NF-κB蛋白表达情况,实验结果显示LL-3显著降低p-P38、NF-κB蛋白表达,以上实验结果表明LL-3可通过抑制LPS诱导的RAW264.7氧化应激,阻滞P38/MAPK、NF-κB信号通路激活从而降低COX-2、iNOS、TNF-α基因转录达到抗炎的目的。线粒体是产生氧化应激的主要场所,用JC-1法检测细胞内线粒体膜电势(MMP)水平,研究发现LL-3升高MMP,减弱了 LPS诱导的线粒体膜功能障碍,综上所述,LL-3通过减少LPS攻击线粒体膜,抑制氧化应激激活P38/MAPK、NF-κB信号通路,降低炎性因子及介质过表达,减缓慢性炎症的发生。由于慢性炎症与阿尔兹海默症(Alzheiemei’s Disease,AD)发生发展密切相关,鉴于LL-3具有较强的抗炎作用,课题进一步研究LL-3神经保护作用。实验结果发现LL-3能够减弱Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤,降低Aβ25-35引起的活性氧(ROS)、脂质过氧化(MDA)增多而显著提高细胞谷胱甘肽(GSH)、过氧化物歧化酶(SOD)的活力,维持细胞内氧化与抗氧化动态平衡,缓解Aβ25-35诱导的氧化应激产生起到神经保护的作用。流式细胞术及DAPI染色结果表明LL-3能够显著削弱Aβ25-35诱导的细胞凋亡的作用,以剂量依赖性的方式明显减少细胞凋亡小体和凋亡细胞的数量。线粒体是细胞内氧化应激生成的主要场所,我们采用JC-1染色及流式细胞术来检测线粒体膜电势(MMP)变化,结果显示LL-3可升高MMP恢复线粒体膜功能。线粒体功能障碍可诱导促凋亡蛋白表达,Western blot实验结果进一步表明化合物LL-3降低细胞内bax、Cleaved caspase-3蛋白、细胞质细胞色素c(Cytoc)的表达量,升高bcl-2蛋白、线粒体Cytoc的表达量,LL-3处理细胞后还可明显降低p53、NF-κB蛋白表达量,说明化合物LL-3可通过抑制氧化应激阻滞p53、NF-κB信号转导途径从而抑制线粒体凋亡来削弱Aβ25-35蛋白诱导的氧化应激式凋亡。综上所述,实验首先对五种火绒草提取物细胞毒性及抗炎活性进行初筛,选取细胞毒性小且抗炎活性高的化合物LL-3用于进一步研究其抗炎作用机制,实验发现LL-3可通过降低LPS进攻线粒体膜,阻滞氧化应激激活P38/MAPK、NF-κB炎症信号通路,降低炎症介质及因子过表达,从而减缓慢性炎症的发生发展。鉴于慢性炎症与AD发生发展密切相关,LL-3又表现出明显的抗炎活性,实验进一步探究其神经保护作用,实验结果发现,LL-3可通过抑制Aβ25-35蛋白诱导的氧化应激,阻滞线粒体凋亡通路激活,从而减缓AD发生发展,表明其可能作为潜在的治疗AD的先导化合物,值得进一步深究。