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目的大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,我国是大肠癌发病率相对低的国家,近年来呈上升趋势。有报道显示,大肠癌的发病率已居恶性肿瘤的第三位,死亡率位列癌症死因的第五位。研究发现与大肠癌发生发展相关的遗传学改变有许多,如APC基因突变、k2ras、p53等。近年来肿瘤的表遗传学改变逐渐受到人们的关注,所谓表遗传是指基因序列没有改变,但其表达发生了可遗传性改变的现象。也就是说表遗传的改变是发生在基因表达调控的水平上。基因组印记属于表遗传的范畴,它是近年发现的一种不遵从孟德尔定律的依靠单亲传递某些遗传学性状的现象,也就是某些基因呈亲源依赖性的单等位基因表达,其另一等位基因不表达或表达极弱,仿佛这些基因的不同亲本来源的一对等位基因上带有某种可供识别的印记而故名,具有这种现象的基因称为印记基因（Imprinted Gene）。LIT1（10ng QTintronic transcript1）是一种印记基因位于人染色体11p15.5,是由于KvLQT1基因的内含子有反义链的转录。KvLQT1是一种负责编码心肌钾离子通道蛋白的基因,基因内的缺失和突变改变了蛋白质的氨基酸序列,进而影响钾离子通道蛋白的功能,造成心肌细胞膜内外离子流的紊乱,使细胞复极时间延长,表现出LQTS的一系列症状。在许多组织中,LIT1母源基因表达,父源基因被印记而表达抑制。有研究认为印记机制破坏在肿瘤的发展中起着重要的作用。本研究组先前研究LIT1基因的印记丢失与BWS（巨大舌-脐膨出综合征）发病有关。所谓的印记丢失（loss ofimprinting,LOI）则是指特定亲本来源的等位基因的正常表达方式的丧失。本实验采用逆转录-聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（RT-PCR-RFLP）方法,研究大肠癌中LIT1基因的杂合丢失和印记状态的改变及相互关系,分析印记基因LIT1与大肠癌的关系,探讨LIT1在大肠癌发生发展中的印记调控机制,并探讨其与大肠癌生物学行为的关系。材料与方法一、实验材料1、实验标本:收集57例人原发性大肠癌患者外科手术切除的癌和远癌组织标本,提取DNA和RNA。2、主要试剂药品及仪器:琼脂糖（美国Amresco）;DNA限制性内切酶（日本TAKARA）;TRIZOL（凯基）;RT-PCR试剂盒、Genefinder核酸染料购自日本TAKARA公司。引物、β-actin由上海生工提供。其余试剂均为国产分析纯。高压灭菌器LS3020（SanYo）,酶连免疫检测仪SUNRISE（TACAN）,低速离心机LM-2A（北京医用离心机厂）,深冻冰箱FORMA SCIENTIFIC（美国）,电泳箱BCK-181A（HAIRE）,PCR扩增仪PTC-100TM（美国）,低温台式离心机ST-21型（SORVALL SURPER）,紫外分光光度计UV-260型（岛津）,电泳仪DYY-Ⅲ5型（美国）,电泳凝胶成像自动分析系统OLYMPUS。电热恒温水浴箱HETW21600（上海跃进医疗器械厂）。二、试验方法1、组织DNA/RNA提取和鉴定取约100mg冻存组织标本,常规用10%SDS/氯仿/乙醇法提取DNA。紫外分光光度法测定A 260/A 280,DNA样品的比值为1.8-2.0为最佳。TRIZOL试剂/氯仿/异丙醇/乙醇提取RNA。2、筛选杂合子标本我们用用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法分析各个标本的基因型。当标本的基因型为杂合状态时,才能为区分两条等位基因的表达产物提供信息。LIT1-F,5’-CAgCACAAAgAggTTTTTgACAg-3’,LIT1-R,5’-gAgTTT-AAAACACgTgTgTgCATT-3’,退火温度54℃,产物片段为410 bp,由上海生工公司代为合成。在20μlPCR反应体系中,含10×PCR buffer 2μl,50mM MgCl21μl,10mM dNTP 0.4μl,10μM引物1.6μl,ddH2O 14μl,TaqE0.2μl,DNA 20μl。PCR反应条件为:94℃2min→（94℃30 s→54℃30s→72℃1min）×30个循环→72℃5min。取PCR产物8μl琼脂糖凝胶电泳,酶切37℃水浴过夜,聚丙烯酰胺凝胶电泳,genefinder核酸染料染色,对杂合子进行筛选。3、基因印记状态检测选择杂合子标本,对其RT-PCR产物用相同的内切酶切,酶切后经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,如果LIT1的基因表达呈双等位基因表达型（AB型）即410bp、222 bp和188bp同时存在,说明发生了印记丢失。如果呈单等位基因表达,即只有410bp（A型）或只有222bp和188bp（B型）,说明转录来自于一条等位基因,即维持正常印记状态（可能由于222bp与188bp片段相差较小,相互重叠,不能清楚显示,故以222 bp为酶切判断标准）。4、统计学处理采用Fisher确切概率法分析LIT1印记丢失与临床病理资料的相关性。所有数据均用SPSS16.0软件进行分析。结果1、PCR产物检测以证实LIT1基因为410bp,通过对PCR反应液的琼脂糖凝胶电泳后图像分析,以成功合成产物。2、杂合标本的筛选57例待测标本中,共筛出9例LIT1杂合标本,其阳性率在大肠癌组织中为15.79%（9/57）。9个杂合的标本的肿瘤组织DNA全为杂合的,无杂合性丢失。3、印记状态检测9个杂合标本的正常组织反转录的cDNA,经PCR后,再经RsaⅠ酶切后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,全为纯合子标本。而印记丢失为4个标本（4/9=44.44%）。结论1、LIT1基因的LOI仅发生在大肠癌组织,癌旁组织无LOI。2、LIT1基因与临床病理学特征（年龄,性别,发生部位等）无统计学相关性,与淋巴结转移有统计相关性。我们推测在大肠癌中,LIT1基因的LOI与淋巴结转移相关。