论文部分内容阅读
槲皮素(Quercetin,QE)是一种广泛存在于水果、蔬菜、植物中的黄酮类化合物,DHA是一种重要的Ω-3多不饱和脂肪酸,对人体健康有着积极的生理功能。二者都具有抗炎、抗氧化、保护心血管方面的功效,因此将DHA和QE进行复配,能否增强其抗炎功能性以及复配后的抗炎作用机理是本研究的重点。本研究通过建立体外、体内炎症模型来探讨DHA和QE单独作用和复配后的抗炎作用,并在分子水平上研究QE和DHA的抗炎机理,主要围绕对NF-κB和MAPKs信号通路的影响展开。研究首先在确定脂多糖(LPS)用量和诱导时间的基础上,通过鼠源RAW264.7巨噬细胞建立体外炎症模型,以NO、PGE2、i NOS和COX-2为判断依据,采用Griess试剂法、ELISA法和Western blot法研究DHA和QE单独作用和复配后抗炎作用;接着,以不同的加药方法和LPS加入的时间不同,建立并发炎症模型和预防炎症模型,用ELISA法分别研究了DHA和QE在RAW264.7细胞中抑制细胞因子表达的作用;随后,在分子水平上用Western blot法研究了DHA和QE在RAW264.7细胞中对NF-κB和MAPKs信号通路的影响;进一步研究DHA和QE对NF-κB和MAPKs信号通路基因调控作用,采用RT-PCR的方法对NF-κB和MAPKs信号通路上蛋白基因表达进行检测,从基因层面探讨DHA和QE的抗炎机理;最后建立体内急性炎症模型来验证体外作用的结果,并从不同角度研究DHA和QE的抗炎作用和机理。主要研究结果如下:(1)通过对LPS不同浓度、不同刺激时间的研究首先确定适合本研究细胞模型的条件(0.1μg/m L LPS诱导24h),进一步结合MTT实验以及已有的研究确定合适的给药剂量,对DHA和QE单独或者共同作用的抗炎效果进行初步探索。结果表明选定剂量的DHA(30μM)、QE(20μM)分别能够抑制NO、PGE2的表达,以及调控NO产生的诱导型NO合成酶i NOS的表达。DHA和QE的共同作用则显示出更加有效的抑制这些促炎因子的表达。其中DHA单独作用对环氧合酶-2(COX-2)的抑制效果不明显(p>0.05),但是与QE复配后二者的共同作用对COX-2的表达显示出了显著的抑制作用,推测二者之间可能存在某种协同作用。(2)在RAW264.7细胞模型的基础上,通过改变LPS、DHA、QE、DHA+QE加入的时间和顺序,建立两种模型来研究DHA和QE在RAW264.7细胞中的抗炎作用。结果表明将DHA、QE、DHA+QE和LPS同时加入到细胞中,以及先加入DHA、QE、DHA+QE预防4h后再加入LPS进行诱导都能起到抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6产生的作用,并且在两个模型中DHA+QE的作用明显大于各自单独作用。同时对DHA和QE能否调节抗炎因子IL-10的表达进行了检测,结果表明DHA、QE、DHA+QE对IL-10的影响没有统计学意义,因此推测可能DHA和QE的抗炎作用不需要通过上调抗炎因子IL-10的表达来实现。结论初步证明DHA和QE对炎症具有一定的治疗和预防作用。(3)DHA和QE对LPS诱导的RAW264.7细胞通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的活性起到抗炎作用。DHA和QE能够分别抑制NF-κB通路上的IκB、p50、p65磷酸化,以及上调IκB的表达,在MAPK通路上DHA能够抑制ERK、JNK、p38的磷酸化,QE只能抑制JNK、p38的磷酸化。但是DHA+QE在抑制p50、p65、ERK、JNK的磷酸化作用时根据Bliss独立模型计算结果,显示出协同效应。对于非磷酸化的IκB、p50、p65、JNK、p38蛋白表达的抑制DHA和QE单独作用的效果不明显,只有DHA+QE的抑制作用显示出统计学意义(P<0.05)。(4)DHA+QE的联合作用对LPS诱导的RAW264.7细胞p50、p65、ERK、JNK、P38持续异常增加的基因表达具有较为显著的抑制作用(P<0.001),对于异常降低的IκB基因也有明显的抑制作用(P<0.001)。然而,DHA(30μM)与QE(20μM)单独作用对RAW264.7细胞p50、p65、ERK、JNK、P38基因表达均未发现具有统计学意义的下调作用(P>0.05)对IκB基因上调也没有有明显的促进作用。(5)在体外模型得到的结论基础上,进一步通过建立内毒素血症小鼠模型,在体内检验DHA和QE的抗炎作用。结果发现高剂量的DHA和QE分别能够提高血液、肝脏和脾脏的抗氧化能力,同时能够抑制促炎因子的基因表达,调控促炎因子的合成和释放。DHA+QE低剂量组产生的抑制细胞因子和细胞因子基因的表达作用远远大于高剂量组单独作用的DHA和QE,并且低剂量组与高剂量组的DHA+QE的抗炎作用没有显著差别。