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可溶性吡咯喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2, sPQQGDH)是一种重要的氧化还原酶,因其在血糖诊断及葡萄糖传感器中的重要应用而受到广泛的关注。但是其低表达水平及较差的热稳定性限制了这种酶的大规模工业化生产及更为广泛的应用,本工作的主要目的是实现sPQQGDH的高效表达及提高其热稳定性。本文首先构建了三个不同的表达载体pET28-gdh, pTrc99a-gdh和pMALc5E-gdh,并以E. coli BL21(DE3)为宿主菌实现了过量表达,其中pET28-gdh的表达效果最好,作为最终的表达载体。探讨了不同的诱导条件、碳源种类及浓度对sPQQGDH可溶性表达及酶活产量的影响,结果表明目的蛋白在对数生长期中期以0.05mM IPTG在25℃下诱导表达可溶性最好,并在含20g／L葡萄糖的MMBL培养基中得到最高表达量。将优化表达体系放大至10L发酵罐,酶活产量可达到1530kU／L,为文献报道最高值的7倍,实现了sPQQGDH的高效表达,向工业化大规模生产迈近一大步。由于融合表达的sPQQGDH带有His标签,可通过Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,实现了高比活(5811U/mg)和较好的回收率(55%)。对纯化的sPQQGDH进行酶动力学参数、热稳定性及底物专一性的分析：Km值为21mM,55℃下半衰期为12.1min,底物专一性较广,可利用麦芽糖等单糖及二糖,这些性质与文献报道天然纯化酶的性质相近,表明融合标签对目的蛋白的结构功能影响很小,可以代替天然酶用于实际应用。针对sPQQGDH热稳定性差的缺点,一方面从添加保护剂的角度对其进行改进,本文对常用保护剂进行筛选和组合,得到了复合保护剂(1%蔗糖,10%甘油和lmg/ml BSA),在一定程度上提高了sPQQGDH的稳定性,55。C下半衰期提高近一倍。另一方面,采用定向进化策略提高sPQQGDH本身的热稳定性。通过易错PCR产生随机突变,并优化了大肠杆菌电转化感受态效率及连接效率,构建了库容量达到104的高容量突变库。建立了全新的高通量筛选具有热稳定性提高的sPQQGDH突变体的方法——以浸透有色底物的滤纸覆盖于热处理过的突变文库,根据滤纸上的颜色变化筛选相应的菌落,结合菌落直接转化法,成功筛选到五处突变Gly263Cys, Thr416Ile, Gln270His, Asp111Glu以及Thr331Met,其中Gly263Cys热稳定性最好,55℃半衰期达到了130min。通过添加保护剂和定向进化筛选大大提高了sPQQGDH的热稳定性,为其更广泛的应用及工业化生产奠定了基础。