硒是动物和人所必需的微量元素之一,具有增强机体抗氧化能力、免疫力,提高繁殖性能,减少糖尿病、心血管疾病、肿瘤疾病的发生和颉颃有毒元素等多种重要的生物学功能。硒以硒半胱胺酸的形式掺入硒蛋白中,通过后者发挥其生物学功能。益生菌具有改善动物胃肠道微生态菌群,抑制胃肠道致病菌的入侵,调节免疫功能,提高饲料利用率和促进生长等生物学功能。前人的研究表明,与无机硒(如亚硒酸钠)相比,有机硒(如富硒酵母,其主要含硒蛋氨酸)的毒性小,而且生物利用率高。富硒益生菌是本实验室研制的饲料添加剂产品,能同时发挥有机硒和益生菌的双重生物学功能,已获国家发明专利。本文研究了日粮添加富硒益生菌对奶牛硒吸收转化、抗氧化能力、泌乳性能和乳中体细胞数的影响,并在细胞和分子水平上探讨其作用机理,为富硒益生菌在奶牛生产上的广泛应用提供理论依据。试验1.日粮添加富硒益生菌对奶牛硒吸收转化效果的影响在考虑试验奶牛的预产期、胎次、上一年度产奶量、年龄和体况分相近的基础上,把36头经产荷斯坦奶牛随机分成4个试验处理组。对照组喂给基础日粮；富硒益生菌(Se-Pro)组喂给基础日粮+Se-Pro 108.2 g/头·天(相当于每头每天补给5 mg Se和320.27x107个活菌数)；益生菌(Pro)组喂给基础日粮+Pro 20.8 g/头·天(相当于每头每天补给320.32x107个活菌数)；亚硒酸钠(Na2SeO3)组喂给基础日粮+Na2SeO3溶液5 ml/头·天(相当于每头每天补给5 mg Se)。试验期为产前30天至产后3个月。于试验的第0、30、60、90和120 d,采集血液样品,用于分析全血Se含量。于产后的第2、30、60和90 d,采集牛奶样品,用于分析乳Se含量。结果,在添饲后的第30、60、90和120 d, Se-Pro组和Na2SeO3组的全血Se含量均显著高于对照组和Pro组(P<0.05)；在产后的第2、30、60和90 d, Se-Pro组和Na2SeO3组的初乳和常乳Se含量均显著高于对照组和Pro组(P<0.05); Se-Pro组的全血和常乳Se含量均高于Na2SeO3组；Pro组与对照组的全血、初乳和常乳Se含量差异均不显著(P>0.05)。结果表明,富硒益生菌提高全血、初乳和常乳Se含量的效果优于亚硒酸钠。试验2.日粮添加富硒益生菌对奶牛机体抗氧化能力的影响试验设计同试验1。试验期为产前30天至产后3个月。于试验的第0、30、60、90和120 d,采集血液样品,用于分析红细胞GPx1活性、血清GPx3活性和血浆MDA含量。结果,在添饲后的第90和120 d, Se-Pro组和Na2SeO3组的红细胞GPx1活性均显著高于对照组和Pro组(P<0.05),而Pro组与对照组的红细胞GPx1活性差异均不显著(P>0.05)；在整个试验期间,Se-Pro组、Pro组和Na2SeO3组的血清GPx3活性与对照组相比差异均不显著(P>0.05)；在添饲后的第30、60、90和120 d, Se-Pro组和Na2SeO3组的血浆MDA含量均显著低于对照组和Pro组(P<0.05),且Se-Pro组的血浆MDA含量均显著低于Na2SeO3组(P<0.05)。结果表明,在提高奶牛机体抗氧化能力和降低血浆MDA含量方面,富硒益生菌优越于亚硒酸钠。试验3.日粮添加富硒益生菌对奶牛泌乳性能和乳中体细胞数的影响试验设计同试验1。试验期为产前30天至产后3个月。产后每个月测产奶量。于产后的第30、60和90 d,采集牛奶样品,用于分析乳成分(乳脂、乳蛋白和乳糖)和体细胞。结果,泌乳期前3个月平均日产奶量(换算成4%乳脂校正奶),Se-Pro组高出对照组2.96 kg·d-1, Pro组高出对照组1.64 kg·d-1, Na2SeO3组高出对照组0.69 kg·d-1。日粮添加富硒益生菌、益生菌或亚硒酸钠对牛奶的乳脂率和乳蛋白率没有影响。Se-Pro组的乳糖率显著高于对照组和Na2SeO3组(P<0.05),而与Pro组比差异不显著(P>0.05)。Se-Pro组的平均牛奶体细胞(SCC)显著低于对照组(P<0.05),但与Na2SeO3组和Pro组差异均不显著(P>0.05)；平均SCC由低到高排序为：Se-Pro组< Na2SeO3组<Pro组<对照组。结果表明,富硒益生菌有提高奶牛产奶量的趋势。富硒益生菌对乳脂率和乳蛋白率没有影响,但能显著提高乳糖率；富硒益生菌降低牛奶SCC的效果比益生菌和亚硒酸钠好。试验4.原代牛肝细胞的分离和培养方法的建立本试验采用胶原酶灌注消化法,对来自新生小牛血清制备厂的牛肝脏尾状突材料进行肝细胞分离,用台盼蓝拒染法测定总细胞数和肝细胞即时存活率,以每孔1×106个肝细胞的量接种于牛尾胶原包被的6孔细胞培养板,进行单层培养细胞形态学观察和培养基上清液LDH活力测定。结果,每头小牛肝脏尾状突分离获得的细胞产量为(3.558±0.228)×108个,肝细胞即时存活率为(84.46±3.56)%,培养24-72 h阶段的肝细胞生长状态最好,适合用于有关肝细胞代谢、中毒、基因表达的研究。试验5.牛肝细胞中GPx1、GPx4及D1mRNA表达水平Real-time PCR检测方法的建立根据已知牛的β-actin、GPx1、GPx4和D1基因的mRNA序列,应用生物软件辅助设计并合成4对特异性引物；以Oligo dT为引物,对从鸡肝细胞中抽提的总RNA进行反转录,合成第一链cDNA;以cDNA为模板,分别进行4个目的基因片段的PCR扩增；胶回收PCR产物,把它们克隆到pMD18-T载体上并测序；对抽提的重组质粒进行拷贝数测定,以10倍梯度稀释的质粒作为标准模板进行PCR扩增,同时对荧光定量PCR反应的引物浓度和退火温度进行优化。结果,4对引物分别扩增出一条目的带,且大小与预期相符合；荧光定量PCR反应的最佳引物浓度是10μmol·L-1,最佳退火温度为62℃；扩增β-actin、GPx1、GPx4和D1基因的4对引物的扩增效率分别为91.99%、96.04%、96.51%和91.61%；各荧光定量PCR产物熔解曲线均显示单一峰。结果表明,本试验成功地建立了检测牛肝细胞中GPx1、GPx4和D1mRNA水平的荧光定量PCR方法。试验6.不同硒形式和浓度对原代培养牛肝细胞GPxl表达的调控来自新生小牛(1-2日龄)的原代肝细胞单层用0(对照)、0.5、1、1.5、2、3、4和5μmol·L-1(以Se计)硒蛋氨酸(Se-Met)或亚硒酸钠(Na2SeO3)或硒卡拉胶(Se-Car)孵育培养24 h。结果,0.5-5μmol·L-1 Se-Met、0.5-1μmol·L-1 Na2SeO3和0.5μmol·L-1 Se-Car处理组的LDH漏出显著低于对照组,但是2-5μmol·L-1 Na2SeO3和3-5μmol·L-1 Se-Car处理组的LDH漏出显著高于对照组,呈剂量依赖模式；所有Se处理组的细胞内还原型GSH浓度均显著低于对照组；所有Se处理组的GPx1 mRNA水平均显著提高,最大值分别出现在3μmol·L-1 Se-Met、1.5μmol·L-1 Na2SeO3和2μmol·L-1 Se-Car;而且3μmol·L-1 Se-Met处理组的GPx1 mRNA水平在所有Se处理组中最高；在达到最高水平之后,再增加Se浓度则导致GPx1 mRNA水平下降；除了变化幅度小些外,GPx1活性的变化模式与GPx1 mRNA的相似。结果表明,不同Se形式和浓度对原代培养牛细胞GPx1 mRNA水平和活性的调控是有差异的；支持牛肝细胞GPx1充分表达的不同Se形式的最佳浓度各有不同；Se-Met的作用效果最好。试验7.不同硒形式和浓度对原代培养牛肝细胞GPx4和D1mRNA表达的影响来自新生小牛(1-2日龄)的原代肝细胞单层用0(对照)、0.5、1、1.5、2、3、4和5μmol·L-1(以Se计)硒蛋氨酸(Se-Met)或亚硒酸钠(Na2SeO3)或硒卡拉胶(Se-Car)孵育培养24 h。结果,与对照组比,所有Se处理组的牛肝细胞GPx4 mRNA水平均显著降低,而所有Se处理组的牛肝细胞D1 mRNA水平均显著升高；不同Se形式处理组的D1mRNA最大值分别出现在1.5μmol·L-1 Se-Met组、1μmol·L-1 Na2SeO3组和1μmol·L-1 Se-Car组；而且1.5μmol·L-1 Se-Met处理组的D1 mRNA水平在所有Se处理组中最高；在达到最大值后,再增加Se-Met、Na2SeO3或Se-Car浓度则导致D1 mRNA水平下降,且呈剂量依赖模式。结果表明,满足牛肝细胞GPx4 mRNA充分表达的Se浓度相对较低(推测<0.5μmol/L);不同Se形式在调控牛肝细胞D1 mRNA表达方面存在差异；支持牛肝细胞D1 mRNA充分表达的不同Se形式的浓度各有不同；Se-Met的作用效果最好。