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十字花科植物根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)侵染引起的一种世界性病害,任何十字花科植物都能被侵染。近年来,由于我国食用和工业用十字花科植物的规模化种植,加剧了根肿病的危害,在农业生产上造成重大损失,探索有效的病害防控方法常借助于对病原菌侵染和生活史的研究成果,但芸薹根肿菌的专性寄生特性以及其生活史的复杂性使得此病的研究困难,目前,对根肿菌的认识仍不完全,根肿病的防控研究也进展缓慢。为了找到一种恰当的诱使根种菌侵染寄主的方法,以方便接种和全面观察,本文通过水培寄主,并进行根部避光处理和不同条件下的侵染试验,获得了一套促进根种菌侵染的水培体系,在此体系基础上,研究根肿菌生活史中关于初生游动孢子和次生游动孢子去向的问题,即初生游动孢子是否只侵染根毛以及次生游动孢子能否再侵染根毛的问题,研究结果如下:
1、休眠孢子囊萌发
将-20℃条件保存的根肿肿块解冻后搅成匀浆,通过过滤离心进行初步纯化,运用2%氯胺-T和1μg/mL硫酸粘杆菌素(Colistin sulfate),1μg/mL盐酸万古霉素(Vancomycin hydro chloride),6μg/mL头孢塞肟钠(Cefotaxime sodium)消毒,经过离心洗涤后制成休眠孢子囊悬浮液。
水培甘蓝收集含根分泌物的培养液,调节pH至6.2并过滤灭菌后,作为休眠孢子囊萌发基质。此种条件下休眠孢子囊在培养第15天萌发萌发率最高,为6.4%。
2、水培养接种方法及条件
10mL离心管用黑胶布包裹使其不透光,并用1cm厚泡沫固定幼苗,从而排除了水培条件下藻类生长对侵染以及观察的影响。根毛侵染的最适pH值为5.5,最适温度为25℃,最适接种浓度为107个孢子/mL,此最适条件下水培接种5天后,根毛内部可观察到根肿菌原生质团。接种8天后于根部观察到大量肿大根毛,根毛内开始出现规则圆形的游动孢子囊,此后逐渐增多,到接种10天后,内部可见明显孢子囊的根毛数量可达208根/株,有的孢子囊内部原生质割裂成为8个均等的部分,即将形成游动孢子,再经过1天,部分次生游动孢子排到游动孢子囊外,在根毛管腔内游动。排空的孢子囊呈透明状。而后,游动孢子囊变形,在根毛内集结成碎片状,主根及侧根长出新的肿大根毛。接种20天后,根部出现明显的根肿肿瘤,通过切片观察到寄主皮层细胞中存在大量休眠孢子囊,说明根肿菌已在寄主体内完成其生活史。从接种开始连续12天检测了培养管中所接种的休眠孢子囊的萌发率,结果发现,休眠孢子囊从接种后第3天开始萌发,这比根毛中首次观察到根肿菌的时间早1天,接种第9天后萌发不再增加。
3、初生游动孢子侵染部位观察
为了确定初生游动孢子是否侵染除寄主根毛以外的其他部位,用寄主根分泌物刺激休眠孢子囊萌发,并在休眠孢子囊萌发高峰期接种寄主。试验结果发现,初生游动孢子不仅可侵入根毛,而且可侵入表皮细胞。为了进一步研究表皮细胞中形成的次生游动孢子是否被排到体外再侵染其他植株,将表皮细胞中含游动孢子囊的根部根毛切除后接种寄主幼苗,发现表皮细胞中形成的次生游动孢子可以被排到原寄主体外,再侵染新幼苗根毛和表皮细胞。
4、无性短循环验证
通过设计两种试验方案,探究芸薹根肿菌侵染过程中是否存在无性短循环:用被侵染的根部接种健康幼苗后获得被侵染的根毛,并用其再接种健康幼苗,以及健康幼苗用被侵染的根部接种后再与健康幼苗并种于同一培养管中此两套方案。研究结果发现,根肿菌在侵染5种十字花科寄主过程中,存在着无性短循环过程,即根毛内形成的次生游动孢子能被排出再侵染原寄主其他根毛或者其他植株的根毛。