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立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）为无性型真菌,属丝孢纲无孢目,是一种寄主范围广、腐生性强、分布广泛的土传病原真菌,可危害禾本科、豆科、茄科和锦葵科等40多科260多种植物,并造成严重损失。立枯丝核菌还没有完善的遗传转化体系,其基因功能研究进展缓慢,尽管根据基因组、转录组、蛋白组和代谢组等组学数据,有少部分与立枯丝核菌致病相关基因被研究,但大部分基因功能仍有待验证。另外,由于立枯丝核菌具有强腐生性,且病害的发生受环境影响较大,因此运用抗病品种、农业措施、物理措施和生物措施等对其防效并不理想,目前生产上对其造成的病害防治主要依赖化学药剂。但过量过频的使用化学药剂,易造成非靶标性杀灭以及抗药性、再增猖獗和农药残留等“3R”问题。因此,研发新的基因功能研究方法和防治策略是当前立枯丝核菌病害研究的主要任务。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是真核生物中普遍存在的机制,其已成为病原真菌基因功能研究和作物病害防治的重要手段。但以往基于RNAi的技术均是建立在转基因基础之上,而许多植物和病原真菌很难被遗传操作,如立枯丝核菌,再加上世界各国对转基因农产品的接受度低,因此这些方法的安全性和广适性也一直受到质疑。喷施诱导的基因沉默（Spray-induced gene silencing,SIGS）通过外源喷施dsRNA诱导病原物靶标基因沉默,不需要建立病菌遗传转化体系,也不需要形成转基因作物,因此,在立枯丝核菌基因功能和病害防治研究方面具有重要意义。在此基础上,我们研究了立枯丝核菌相关基因功能,并初步获得可用于立枯丝核菌病害防治的dsRNA纳米农药,结果如下:1、将荧光素标记的EGFP-dsRNA与立枯丝核菌菌丝共孵育24 h,可观察到菌丝内有强烈荧光,将带荧光的菌丝制备成原生质体仍能检测到荧光,表明立枯丝核菌可以吸收环境中的dsRNA进入细胞内。2、根据基因组和转录组数据,克隆了立枯丝核菌多聚半乳糖醛酸酶基因RsPG1、过氧化氢酶基因RsCAT和钙调神经磷酸酶敏感的锌指蛋白基因RsCRZ1,并体外转录合成分别靶向3个基因的dsRNA片段。将dsRNA与立枯丝核菌共孵育24 h后进行qRT-PCR,结果显示,外源dsRNA可使靶基因沉默,沉默效应为57.4%～68.7%。除RsCAT基因沉默影响立枯丝核菌菌核形成外,各基因沉默几乎不影响立枯丝核菌的生物学性状。3、将分别靶向RsPG1、RsCAT和RsCRZ1基因的dsRNA喷施于玉米叶片表面,接种立枯丝核菌3d后,处理叶片中立枯丝核菌相关基因的表达水平下降了 64.5%、59.6%和68.7%,菌株生物量分别降低了 65.5%、59.6%和68.1%,病斑面积减少了 67.9%、52.5%和70.8%,说明这些基因均在立枯丝核菌致病过程中起重要作用。另外,立枯丝核菌RsCAT基因的沉默可导致其侵染寄主时,寄主的ROS反应加剧,RCCRZ1基因沉默导致其下游基因RsNCS转录水平下调。4、将荧光素标记的EGFP-dsRNA喷施于玉米叶片表面,共聚焦显微镜观察结果显示,荧光信号主要聚集在叶片维管束附近,沿维管束从喷施部位向远端延伸,且受伤叶片中荧光信号远强于完整叶片。说明作为立枯丝核菌的寄主作物,玉米可以吸收外源喷施的dsRNA,且可将吸收的dsRNA通过维管束系统输送至其他部位。5、将dsRNA与双层氢氧化物纳米材料LDH进行共孵育,当其质量比为1:2时,2h才能完全加载;当质量比为1:16时,仅需孵育30 min即可完成加载。叶面喷施荧光素标记的EGFP-dsRNA-LDH,与未加载至LDH的EGFP-dsRNA相比,叶片内荧光信号显著增强。在玉米叶片表面喷施RsCRZ1-dsRNA-LDH并接种立枯丝核菌,20 d后病斑仍维持较小水平,且喷施后20 d叶片中仍可检测到RsCRZ1-dsRNA;而仅喷施RsCRZ1-dsRNA,叶片中的dsRNA仅可存留3 d左右。说明LDH加载dsRNA形成dsRNA-LDH复合物可以提高dsRNA进入寄主细胞的效率,且提供更长的保护时间。6、另外,为获得更加廉价的dsRNA,控制成本,我们构建了表达dsRNA的L4440载体,将之转入大肠杆菌HT115感受态获得稳定表达dsRNA菌株,这将为后续dsRNA在田间的应用奠定基础。