大面积烧伤后的皮肤和粘膜组织常合并有感染。近年来，由于细菌耐药性菌株的不断出现，使得传统抗生素治疗面临着严峻的挑战，因感染而造成的烧伤病人的死亡率一直居高不下，因此寻找新型的、无细菌耐药性的抗生素极其重要。近年研究发现，真核生物能够产生大量的抗微生物肽，广泛参与抵制和杀灭外源性致病微生物的侵袭，构成机体宿主防御的一个重要途径。由于这些蛋白在机体内天然存在，不产生耐药性，因此有希望开发为新型的抗生素，解决临床上因传统抗生素耐药而出现的被动局面。 防御素是一类机体内广泛存在的抗微生物肽，对细菌、真菌等病原微生物具有广谱的杀伤作用，且不产生耐药性。已知的防御素依其结构特征和来源不同，分为植物防御素、昆虫防御素和脊椎动物防御素。脊椎动物防御素主要有两类，即α-防御素和β-防御素。其中α-防御素主要分布在中性粒细胞等免疫系统的细胞中，而β-防御素则主要由上皮细胞合成和分泌。迄今为止发现的人类β-防御素共有3种，分别命名为β-防御素1，2，3(human beta-defensin1，2，3，hBD1，2，3)，其基因均定位于人第8号染色体上8p22-8p23区间<1Mb的范围内，分别编码36个氨基酸、65个氨基酸和45个氨基酸的短肽，其分子中均含有由6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键。hBD1在肾小管、胰腺、肺、乳腺、腮腺、眼前房、鼻粘膜以及其它一些组织的上皮细胞中连续性表达。hBD2和hBD3则主要在感染刺激后的皮肤和粘膜组织中表达，因而与这些组织的感染尤其是烧伤后的感染关系更加密切。 β-防御素的分子呈阳性、带正电荷，能够与带负电荷、呈阴性的细菌表面 第四军医大学硕士学位论文 结合，结合后其分子中的疏水区可插入到细菌的胞膜，而其带电区（带正点 荷）则与细菌胞膜上带负电荷的磷脂头部和水分子相互作用。在细胞膜上多 个卜防御素分子聚集形成孔隙或通道，使得正常情况下处于胞外的离子、蛋 白等流人胞内，而胞内重要的盐类、大分子等则泄漏到胞外，最终导致不可 逆性的菌体死亡。另外，由于大多数真菌、支原体、螺旋体等致病微生物的 胞膜也和细菌一样带负电荷，所以也是卜防御素的攻击对象，而高等动物的 细胞则由于细胞膜中负电荷含量较低而免于受到攻击。 hBD3于2000年由Harder等首次从人的牛皮癣病灶皮肤提取物中分离得 到，并成功地克隆了其CDNA序列。hBD3对革兰氏阴性、阳性细菌以及真菌 等多种病原微主物具有杀伤作用，尤其是对包括金黄色葡萄球菌在内的革兰 氏阳性菌作用最强。初步研究发现，皮肤和扁桃体中hBD3最丰富，在体外 培养的皮肤角质形成细胞和肺上皮细胞的上清中hBD3含量较多。另外，大 肠杆菌表达的hBD3与天然的以及合成的hBD3蛋白具有相同的生物学活性， 提示该蛋白有望开发成为一种新型的肽类抗生素，解决临床上常见而棘手的 传统抗生素细菌耐药性问题。同时，深入研究hBD3的表达调控机理也有助 于寻找相应的途径以提高上皮细胞表达卜防御素的水平，调动机体自身的抗 菌潜能。 本课题首先提取了人正常皮肤组织的总RNA，然后采用RTPCR的方法 克隆了hBD3的cDNA全长序列，并将其克隆到pGEM1上asy载体中，在大 肠杆菌中扩增。酶切和PCR鉴定以及基因测序表明，所获得的序列与GenBank 中报道的序列完全一致，无碱基缺失或突变。在此基础上，我们重新设计引 物从pGEM1－hBD3重组质粒中克隆到hBD3成熟肽基因序列，连接到 pGEX4Tl载体中，在DH5a中扩增，在0．lrnM IPTG诱导下，在BLZI菌株 中表达hBD3－GST融合蛋白。蛋白以包涵体形式存在，经超声裂解和变性、 复性后过 SP＊Cpharose FF层析柱，再经凝血酶处理使重组的 hBD3（recombinp hBD3，hBD3）从 bBD3七ST融合形式中解离下来。解离下来的 hBD3经 Glutathione Sepharose 4B纯化而获得。活性分析表明，sD3具有抗菌活性， 对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为4pg／Inl，对大肠杆菌的最小抑菌浓度为 4 第四军医大学硕士学位论文 一 8卜g／mlo 用hBD3－GST融合蛋白免疫家兔获得了效价为1：250的多克隆抗血清，对 hBD3－GST和 hBD3的 Western blot分析表明，该多抗对 hBD3反应特异。 用ECOR酶切从 pGEM＊－hBD3重组质粒中获得hBD3的CDNA全长基 因，并将其连接入ECOR处理的pCDNA3质粒，构建pCDNA3－hBD3真核表 达载体。采用脂质体转染法用pCDNA3－hBD3质粒转染COS刁细胞，在G418