目的：克隆和分析ZFP580基因cDNA开读框架全编码区(编码172个氨基酸)、N端编码区(编码1-88位氨基酸)、C端C2H2型锌指主构域编码区(编码89-172位氨基酸)。构建ZFP580基因原核表达载体并鉴定，诱导表达GST-ZFP580融合蛋白。 方法： 1.从正常大鼠小脑组织中提取总RNA。 2.根据GenBank公布的大鼠ZFP580基因cDNA开读框架序列设计引物，用RT-PCR的方法扩增ZFP580基因cDNA开读框架以及ZFP580基因的N端编码区和C端编码区。 3.用T-A克隆方法将目的基因克隆至pMD18-T-Easy载体中，挑取琼脂板上的白色菌落，接种于5ml含有Amp的LB液体培养基中，37℃摇菌培养过夜。用碱裂解法小剂量制备重组质粒。采用BglII和XhoI双酶切法、PCR法及测序法鉴定重组质粒。构建成功的阳性重组质粒记作pMD18-T-ZFP580。同法成功克隆ZFP580基因N端编码区和C端编码区，阳性重组质粒记作pMD18-T-N、pMD18-T-C。 4.用BglII和XhoI对克隆载体pMD18-T-ZFP580和原核表达载体pET-42a(+)分别进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳酶切产物，纯化回收带有粘端的ZFP580基因和pET-42a(+)载体。将ZFP580基因和pET-42a(+)表达载体用T4DNA连接酶连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞，加LB液体培养基，37℃培养60min。将菌液均匀涂布于含Kan的LB琼脂平板上，于37℃培养箱中培养12-16h。挑取琼脂板上的单菌落，接种于5ml含有Kan的LB液体培养基中，37℃摇菌培养过夜。用碱裂解法小剂量制备质粒进行鉴定。阳性重组质粒记作pET-42a-ZFP580。同法成功构建ZFP580基因的C端编码区，阳性重组质粒记作pET-42a-C。阳性重组质粒用双酶切的方法鉴定并双向测序，确认有无读码框错误。 5.阳性重组载体pET-42a-ZFP580转化Ecoli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，优化表达条件，确定最佳表达参数，SDS-PAGE分析鉴定GST-ZFP580蛋白的表达。 6.生物信息学分析ZFP580基因结构和功能。 结果： 1.甲醛变性琼脂糖凝胶电泳呈现清晰的28S和18S两条带，并且28S宽度以及亮度是18S的2倍，5S量较少。证实所提取总RNA完整性高。测OD260/OD280比值1.9左右，证明总RNA纯度高，无蛋白质和酶等抑制物残留。 2.RT-PCR扩增后，在519bp附近出现了一条特异性条带，此DNA条带与大鼠ZFP580基因cDNA开读框架全编码区的大小相符合。测序证明已获得ZFP580基因开读框架，其序列与GenBank中预测序列完全一致。同法获得264bp和252bp大鼠ZFP580基因的N端编码区和C端编码区。序列比对结果证实与GenBank中预测的一致。 3.T-A克隆构建获得的阳性克隆载体pMD18-T-N、pMD18-T-C、pMD18-T-ZFP580，用Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ双酶切和PCR法鉴定。结果表明，上述三个克隆载体己成功构建。 4.原核表达载体pET-42a-ZFP580、pET-42a-C经鉴定证实构建成功。测序证实pET-42a-ZFP580载体无读码框的错误，转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导，SDS-PAGE鉴定分析GST-ZFP580融合蛋白表达情况。 5.小剂量多次进行蛋白表达实验，未能诱导表达目的蛋白。深入探讨了未能表达目的蛋白的原因。 6.大鼠ZFP580基因cDNA全长1100bp，完整开读框架为519bp，编码一个含有172个氨基酸的蛋白质，所编码的蛋白与锌指蛋白相似有2个功能结构域：N端的富含脯氨酸结构域和C端的3个C2H2型锌指结构。 结论： 1.大鼠ZFP580基因cDNA开读框架全编码区、大鼠ZFP580基因的N端编码区和C端编码区与GenBank中预测序列完全一致。 2.成功构建克隆载体pMD18-T-N、pMD18-T-C、pMD18-T-ZFP580和原核表达载体pET-42a-ZFP580、pET-42a-C。 3.原核表达载体pET-42a-ZFP580读码框正确无误，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE分析表达情况。小剂量多次进行蛋白表达实验，未能诱导表达目的蛋白。 4.详细分析大鼠ZFP580基因结构和功能，大鼠ZFP580基因开读框架编码一个含有172个氨基酸的蛋白质，所编码的蛋白与锌指蛋白相似有2个功能结构域。