幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是一种选择性定植于胃上皮细胞的革兰氏阴性菌。这种微生物可以在体内定植几十年,越来越多的研究表明H.pylori在胃黏膜层中可以接受和传递信号,调节宿主与细菌之间的动态平衡。若长期感染H.pylori,会显著增加患者发生萎缩性胃炎,肠化生,胃癌的风险。广藿香是中国传统的中药,具有味辛、性微温,归脾、胃、肺经,主治湿浊中阻、胺痞呕吐、腹痛吐泻等消化道疾病。现代研究表明广藿香的有效成分主要是挥发油,其中百秋李醇(Patchouli alcohol)是主要成分。本课题研究百秋李醇对H.pylori感染相关胃炎的治疗作用及其机制。目的:通过研究百秋李醇对H.pylori酸抵抗能力的影响及其机制,探讨药物清除体内H.pylori作用靶点;建立H.pylori感染细胞模型,研究百秋李醇对H.pylori感染细胞模型保护和抗炎作用及其机制;建立H.pylori感染相关慢性胃炎动物模型,验证百秋李醇治疗H.pylori感染相关慢性胃炎的作用及其机制;方法:1.百秋李醇对H.pylori酸抵抗能力和其毒力因子的影响及其作用机制1.1百秋李醇对H.pylori生存率的影响研究培养并通过形态学观察、快速尿素酶法(RUT)和PCR法鉴定H.pylori,使用琼脂释放法检测在酸性(pH=5.3)和中性(pH=7.0)条件下百秋李醇对细菌存活率的影响。1.2百秋李醇对H.pylori酸抵抗能力的影响及其作用机制的研究培养并鉴定H.pylori,使用pH shock法检测百秋李醇对H.pylori酸抵抗能力的影响;Berthelot显色法检测酸性和中性条件下百秋李醇在对H.pylori体内尿素酶活性的影响;RT-qPCR法检测在酸性和中性条件下百秋李醇对H.pylori的尿素酶相关基因ureA,ureB,ureE,ureH,ureI和nixA的表达的影响;通过E.coli系统表达并纯化尿素酶辅酶蛋白UreG,体外模拟UreG合成和分解过程,探索百秋李醇的作用靶点。1.3百秋李醇对H.pylori毒力因子表达的研究培养并鉴定H.pylori,RT-qPCR法检测百秋李醇对H.pylori毒力因子cagF,oipA和cagE的基因表达的影响。2.百秋李醇对H.pylori感染细胞模型的作用及其机制研究2.1 Hpylori感染细胞炎症模型的建立及评价培养MKN45细胞,与H.pylori共孵育6、12和24小时建立感染模型,台盼蓝染色和乳酸脱氢酶(LDH)测定感染细胞存活率;罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位(MMP)。培养RAW264.7细胞,与H.pylori共孵育6、12和24小时建立感染模型,Griess法检测感染细胞上清液中NO的含量变化;RT-qPCR法检测感染细胞中Tnf-α,Inos和Cox-2基因表达变化。2.2百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞损伤的保护作用及其机制研究使用CCK-8法检测百秋李醇对MKN45细胞的毒性;建立H.pylori感染MKN45细胞模型后,通过台盼蓝染色和LDH法测定百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞生存率的影响;DCFH-DA和罗丹明123染色法分别检测百秋李醇对H.pylori感染细胞中活性氧含量和MMP水平的影响;AnnexinV/PI法检测百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞的凋亡影响;生化方法检测百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量变化;RT-qPCR法检测百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞中促炎因子和细菌毒力因子的基因表达影响;ELISA法检测百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞上清液中促炎因子的蛋白分泌影响。2.3百秋李醇抗H.pylori诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应及其机制研究使用CCK-8和Griess法分别检测百秋李醇对RAW264.7巨噬细胞活性及其产生一氧化氮(NO)的影响。建立H.pylori感染RAW264.7细胞模型后,通过琼脂稀释法检测百秋李醇对RAW264.7细胞吞噬功能的影响;生化方法检测百秋李醇对H.pylori诱导RAW264.7细胞分泌NO和髓过氧化物酶(MPO)的影响;RT-qPCR法检测百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞中促炎因子的基因表达影响;ELISA法检测百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞上清液中促炎因子的蛋白分泌影响。3.百秋李醇对H.pylori感染相关慢性胃炎的治疗作用及其机制研究3.1 H.pylori感染小鼠慢性胃炎模型的建立与评价灌胃H.pylori SS1菌株建立在体感染,感染后第2周后采用RUT和PCR检测感染成功率;确认感染成功后再分别饲养6周和12周,建立H.pylori小鼠慢性胃炎模型。取胃组织腺体部分别进行HE和硼酸美兰染色,分析胃炎及H.pylori感染程度;RT-qPCR法检测胃组织Cox-2,Inos,Tnfα和Il-1p的基因表达变化。3.2百秋李醇对H.pylori感染小鼠慢性胃炎的治疗作用及其机制研究建立H.pylori小鼠慢性胃炎模型,确认模型成功后,再饲养10周后开始持续给药2周。取胃窦和胃体组织分别进行HE和硼酸美兰染色,通过病理切片分析胃炎及H.pylori感染程度,评估百秋李醇对H.pylori感染小鼠慢性胃炎模型的治疗作用;使用生化方法检测百秋李醇对H.pylori感染小鼠胃炎中胃组织内氧化应激相关指标的影响;RT-qPCR方法检测百秋李醇对H.pylori感染小鼠胃炎中胃组织内细胞因子和细菌尿素酶基因的表达影响;流式微球阵列分析法(CBA)检测百秋李醇对H.pylori感染小鼠胃炎动物血清中促炎因子含量水平的影响。结果:1.百秋李醇对H.pylori酸抵抗能力和其毒力因子的影响及其机制研究结果在中性和酸性(pH=5.3)条件下,百秋李醇在20 mg·L-1范围内对H.pylori生存率无影响;而在强酸性(pH=1.0)条件下,百秋李醇表现出明显的杀菌效果;进一步研究中发现百秋李醇在中性和酸性(pH=5.3)条件下对H.pylori体内的尿素酶活性具有明显的抑制作用,同时对于尿素酶的相关基因ureA,ureB,ureE,ureH,ureI和nixA的表达均有不同程度下调作用;但对UreG蛋白的合成分解过程无明显影响。百秋李醇对H.pylori的于毒力因子oipA和cagE的基因表达也有显著抑制作用;2.百秋李醇对H.pylori感染细胞模型的作用及其机制研究结果2.1 感染细胞模型的建立及评价结果H.pylori感染MKN45细胞模型中,12、24小时均可显著降低细胞存活率和MMP,其中共培养24小时产生细胞的毒性作用更强;H.pylori诱导RAW264.7细胞炎症模型中,6、12和24小时均可增加细胞上清液中NO含量和细胞中Tnf-α,Inos和Cox-2的基因表达,并随着时间的延长而加强。2.2百秋李醇对H.pylori感染MKN45细胞损伤的保护作用及其机制研究结果百秋李醇可以提升H.pylori感染MNK45细胞的生存率,并抑制其凋亡;降低细胞表达促炎因子,提升抗氧化酶活性,恢复细胞MMP水平有关;同时还具有降低感染模型中细菌毒力因子的基因表达效果。2.3百秋李醇抗H.pylori诱导RAW264.7巨噬细胞的炎症反应及其机制研究结果百秋李醇可以抑制H.pylori感染RAW264.7模型细胞的促炎因子和NO的生成;降低感染模型分泌的氧化酶的活性;同时还具有促进巨噬细胞清除细菌的作用。3.百秋李醇对H.pylori感染相关慢性胃炎的治疗作用及其机制研究结果3.1H.pylori感染小鼠慢性胃炎模型的建立与评价结果模型6周和12周组胃组织内可见H.pylori定植,并且黏膜层有不同程度的慢性炎性细胞浸润,腺体萎缩和肠化生情况,其中12周模型出现腺体萎缩和肠化生的情况;同时组织Cox-2,Inos,Tnfα和Il-1β的基因表达均有显著上升;12周模型的炎症程度高于6周。3.2百秋李醇对H.pylori感染小鼠慢性胃炎的治疗作用及其机制研究结果感染12周模型组动物的胃体和胃窦组织均出现大量H.pylori定植,并且表现出慢性萎缩性胃炎的组织病理学形态,胃窦处还出现了肠化生的现象。同时模型组动物体内促炎因子表达和氧化应激相关指标均显著上升。经过百秋李醇治疗之后,20 mg·L-1剂量组在胃体和胃窦组织中不仅表现出了清除H.pylori的效果,还展现了良好的抗炎效果,同时也有减少胃体部腺体萎缩的作用:百秋李醇对于感染动物体内促炎因子表达和氧化应激相关指标均表现出不同程度的抗氧化能力和抑制促炎因子表达的作用,其中百秋李醇20 mg·L-1效果最佳。结论:百秋李醇具有治疗H.pylori相关慢性胃炎的作用,其机制可能是通过减少H.pylori体内尿素酶生成,降低细菌的酸抵抗能力,清除体内定植的H.pylori;同时抑制促炎因子和氧化应激的过度表达,从而发挥抗炎作用,改善H.pylori相关慢性胃炎的症状。