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背景:反复胚胎种植失败（recurrent implantation failure,RIF）是指经历≥3次优质胚胎移植或累积移植的胚胎数量≥10枚,仍然未获得临床妊娠者。RIF造成了胚胎资源的极大浪费,给患者造成了巨大的经济损失和身心压力,是目前辅助生殖领域中尚未解决的一大难题。RIF病因复杂且高度异质,包括胚胎因素（卵子、精子因素等）、子宫因素（先天性子宫结构异常、获得性宫内疾病、内膜薄和子宫内膜炎等）、输卵管积水和免疫因素等,但仍有部分患者无法诊断种植失败的原因（称为不明原因RIF）。内膜容受性用于描述内膜在“胚胎种植窗”（月经周期20-24天）内对胚胎的容受能力,确保胚胎可以完成黏附、侵袭和迁移的过程,最终植入到内膜深层。内膜容受性的建立主要受到卵巢雌激素和孕激素的调节,并且需要各种转录因子、细胞因子和信号通路的相互作用。研究报道,宫内疾病可以导致孕激素抵抗和一些重要蛋白（如HOX基因家族、白血病抑制因子、αvβ3整合素等）的表达变化进而干扰子宫内膜容受性,影响胚胎种植过程,但既往研究多注重蛋白编码基因在内膜容受性建立和维持过程中的作用机制,这并不足以解释RIF发生发展过程的复杂性,尤其是不明原因RIF的发病机制仍有待进一步探讨。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类呈广泛分布、共价闭合的环状RNA分子,可以抵抗核糖核酸外切酶-RNase R的降解,比线性RNA更稳定,在不同物种间具有高度保守性,在表达上具有明显的时间特异性和组织特异性。CircRNA的作用机制多样,可以作为“海绵分子”吸附miRNA、或者蛋白,进而干扰miRNA和蛋白的生物学功能;也可以与细胞核和细胞质中的蛋白相互结合,进而影响其发挥作用;甚至可以编码蛋白多肽等。越来越多的研究表明,circRNA可能参与多种疾病的发生发展过程,如神经系统疾病、心血管疾病、内分泌疾病以及各种癌症等。既往研究表明circRNA在内膜容受性的调节中有重要作用,目前有研究报道了在3例vs.3例RIF和对照患者黄体期内膜组织中circRNA的表达变化,但至今为止,关于circRNA在RIF发生发展中的重要作用仍缺乏进一步的功能研究和相关机制探讨。目的:明确RIF患者黄体期子宫内膜组织circRNA的表达谱,深入探讨差异表达circRNA在子宫内膜容受性建立过程中的功能和潜在分子机制,从表观遗传学的角度阐述RIF的发生发展机理,并为其临床诊疗提供研究基础。方法:应用Arraystar Human circRNA Array V2芯片对8例对照和8例RIF患者的黄体期内膜组织进行circRNA表达谱检测;在数据分析的基础上,我们根据Fold change、P value和表达丰度筛选出部分差异表达的circRNA,设计“背对背”引物在16 vs 17的对照和病例样本中进行RT-qPCR验证。我们通过RNase R实验和Sanger测序验证circSTK40的环状RNA属性,并采用子宫内膜组织原代细胞分离、核质分离和FISH实验检测其细胞分布和亚细胞定位。CircSTK40的细胞功能研究是通过构建腺病毒过表达载体,在内膜基质细胞系THESC和原代细胞hESC中过表达circSTK40后,进行体外诱导蜕膜化、TUNEL、Western blot、EdU和细胞周期检测等实验观察细胞蜕膜化程度、凋亡和增殖等生物学过程的变化情况。为进一步研究circSTK40作用的分子机制,我们通过转录组测序和RNA pull-down联合质谱分析实验检测circSTK40下游基因的表达变化和寻找直接结合的相关蛋白,然后采用RNA 免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）、免疫沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）等实验技术检测RNA和蛋白、蛋白和蛋白之间相互作用的变化,并探究激活/失活的下游信号通路。最后通过AKT抑制剂MK2206和HSP90抑制剂17AAG进行挽救实验明确circSTK40调控细胞表型变化的分子机制。结果:在circRNA芯片结果检测出的1436条差异表达circRNA中,我们筛选出了 17条circRNA在17 vs.16的RIF和对照组独立样本中进行验证。其中,来源于STK40基因第4、5外显子的circSTK40（circBase数据库:hsacirc0011692）表达丰度最高。我们发现circSTK40比其STK初的线性mRNA更能耐受RNase R的降解,并通过原代细胞分离、核质分离和FISH实验确定了其在内膜基质细胞的细胞质和核中均有分布。体外诱导蜕膜化、TUNEL、BCL2/BAX的Western blot、EdU和细胞周期实验结果显示,过表达circSTK40干扰了内膜基质细胞的蜕膜化过程（蜕膜化标志基因PRL和IGFBP1的mRNA表达水平降低）;抑制了分化后细胞凋亡（氧化应激情况下TUNEL阳性信号减少,BCL2/BAX蛋白水平比值增加）;同时抑制了分化后细胞增殖（生长速率减慢、处于细胞周期S期细胞减少）;此外,氧化应激处理后的内膜基质细胞中,circSTK40表达上调。Pull-down联合质谱分析以及RIP实验结果显示,circSTK40可以与应激相关蛋白HSP90、CLU直接结合,同时过表达circSTK40可以增加HSP90的蛋白水平,但并未明显改变其mRNA表达水平;采用CHX抑制蛋白合成或MG132抑制蛋白酶体降解通路后,Western blot实验显示过表达circSTK40后,HSP90通过蛋白酶体通路降解减少。进一步采用co-IP实验发现过表达circSTK40同时阻碍了 HSP90和CLU（调节目的蛋白通过蛋白酶体途径降解）或RBBP6（HSP90的预测E3连接酶之一）的相互作用;而与过表达circSTK40对HSP90降解过程的影响一致,敲降CLU同样可以阻碍HSP90和RBBP6相互作用、导致HSP90降解减少。同时,过表达circSTK40导致的HSP90蛋白累积增加促进了其与pAKT的相互作用,进而激活了 AKT通路、降低了 FOXO1蛋白水平;此外,在RIF患者的黄体期内膜组织中,FOXO1的蛋白水平降低。通过AKT通路抑制剂MK2206和HSP90抑制剂17AAG进行挽救实验,结果显示过表达circSTK40后的FOXO1蛋白水平均有一定程度的恢复;同样,过表达circSTK40后细胞蜕膜化表型和凋亡表型也都得到恢复;此外,我们发现,在一定浓度范围内,MK2206和17AAG可以促进内膜基质细胞的蜕膜化过程,表现为PRL和IGFBP1的mRNA水平呈浓度依赖性增加。另一方面,通过转录组测序和RT-qPCR验证,我们发现过表达circSTK40可以下调BMP2的mRNA和蛋白水平,同时RIF患者黄体期内膜组织中BMP2的mRNA水平明显降低;而RNA Pull-down实验显示circSTK40可能与调控BMP2基因表达的转录因子TCF/LEF家族蛋白结合。与过表达circSTK40后的部分表型一致,在内膜基质细胞中敲降BMP2可以干扰细胞的蜕膜化过程、抑制分化后的细胞增殖。结论:CircSTK40可以通过调节HSP90/AKT/FOXO1轴和降低BMP2的表达干扰内膜基质细胞的蜕膜化过程、抑制分化后的细胞凋亡和增殖,降低子宫内膜容受性,导致RIF的发生,但同时可以在应激状态下促进细胞存活。