胰腺癌是早期诊断难、临床治疗效果差、死亡率高、5年生存率低的恶性肿瘤。寻找有效的基因治疗方法是改善胰腺癌预后的重要措施之一。RNA干扰(RNAinterence，RNAi)最初发现于秀丽隐虫(Caenorhabditis elegans)，导入双链RNA后，其细胞内的靶mRNA被降解，其降解的方式是一种序列特异性的。理论上讲，编码疾病相关蛋白的mRNA均可被siRNA(small interfering RNA)选择性的降解。本实验成功地运用表达siRNA的重组质粒载体，特异地抑制了癌基因K-ras在胰腺癌细胞系PC-7和Panc-1细胞内的表达。1、构建表达siRNA的两种重组质粒(1)选择两株胰腺癌细胞中K-ras mRNA切割靶点：本实验所用的细胞系为PC—7和Panc—1胰腺癌细胞系，经过对其K-ras癌基因测序及检测相关信息，得知它们第12位点的点突变模式不相同。PC—7胰腺癌细胞的K—ras的点突变为GGT→GTT，Panc—1的K-ras的点突变为GGT→GCT。登录Pub Med网站验证测序结果的正确性。(2)设计两种siRNA的转录模板：根据测序结果，针对这两种K-ras点突变的不同，设计两种siRNA的转录模板，分别用来抑制PC—7和Panc—1胰腺癌细胞系中的K-ras癌基因。siRNA的转录模板主要包括两侧的粘端，中间一个诱导切割功能的环及连续6个T的内终止序列，环两侧为互补的臂。切割降解的靶序列为突变点周围共19bp的核苷酸。以人工合成法合成siRNA表达模板。(3)重组两种siRNA的表达质粒载体：将合成的siRNA转录模板插入到线性化的pSilencer3．1H1—hygro质粒载体中去，构建成pSilenter—anti—rasl和pSilencer—anti—ras2两种重组质粒。pSilencer—anti—rasl针对PC—7胰腺癌细胞的K-ras mRNA，而pSilencer—anti—ras2针对Panc—1胰腺癌细胞K-ras mRNA。经过在DH5a大肠杆菌中扩增，酶切，然后琼脂糖电泳及测序鉴定序列的正确性。2、验证重组质粒载体表达siRNA对同源癌基因表达的抑制效果为验证外源siRNA对PC—7和Panc—1胰腺癌细胞癌基因K-ras表达的抑制效果及其特异性，我们用hygromycin进行选择性杀伤并以如下方法验证：(1) RT-PCR：提取转染细胞系PC一7／pSilencer—anti—rasl和Pane～1／pSilencer—anti—ras2细胞及其各对照组细胞的总RNA，分别经过逆转录酶合成cDNA，再经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，结果表明：转化细胞系的K-ras mRNA明显下降。(2) Western blot：提取转染细胞及其各对照组细胞的总蛋白，经PAGE电泳及免疫杂交，结果表明：转化细胞系的K-ras蛋白p21明显下降。(3) siRNA模板中心碱基的作用：构建转染细胞PC—7／pSilencer—atni—ras2和Panc—1／pSilenter—anti—rasl，它们的siRNA与其内源K-ras mRNA中心碱基错配。用以上方法验证，结果表明：中心碱基错配的siRNA均不能有效抑制癌基因K-ras的表达。说明RNA干扰是一种保守的高度特异性的生物过程。3、生物学效应(1)细胞计数及生长曲线：转染细胞系PC—7／pSilencer—anti—rasl和Panc—1／pSilencer—anti—ras2细胞的生长均受显著抑制。(2)应用Alamar兰检测细胞的代谢：转染细胞系PC—7／pSilencer—anti—rasl和Panc—1／pSilencer—anti—ras2细胞氧化Alamar兰的能力显著下降，表明细胞的代谢明显降低。(3)将转染细胞系PC—7／pSilencer—anti—rasl和对照组细胞皮下注入Balb／c裸鼠，实验组6只裸鼠14周后仍未见肿瘤形成，而对照组6只裸鼠4周后均有肿瘤形成。表明siRNA使胰腺癌细胞的致瘤能力丧失。我们的研究表明RNA干扰技术是一种十分有效的基因治疗方法，可使胰腺癌细胞的生长代谢受到明显的抑制并使其丧失致瘤能力。siRNA中心碱基在RNA干扰过程中起着十分重要的作用，同时也说明RNA干扰过程是一高度保守和高度特异性的过程。经过对实验结果的综合分析，RNA干扰可以成为胰腺癌临床基因治疗有价值的工具和实验依据。