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牛乳制品含有丰富的营养,同时乳及乳制品也是WHO认定的导致人类过敏的八大类食物之一。其中牛乳中的酪蛋白(casein,CN)及α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-LA)被视为主要的过敏原,因此开展针对食品中酪蛋白及α-乳白蛋白强特异性、高灵敏度的检测具有重要的理论和现实意义。具体研究内容如下:1、酪蛋白、α-乳白蛋白单克隆抗体的制备。以CN、α-LA各免疫4只BALB/c小鼠,用间接ELISA法测小鼠抗血清效价,获得效价最高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,获得杂交瘤细胞。间接ELISA法筛选阳性孔,有限稀释法进行3次亚克隆得到分泌同质的杂交瘤细胞株。最终筛选到1株分泌酪蛋白单抗、2株分泌α-乳白蛋白单抗的杂交瘤细胞株分别为3D3、11G10、11F8。采用小鼠体内诱生腹水法大量制备单抗。2、酪蛋白、α-乳白蛋白单抗的鉴定采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗腹水,经SDS-PAGE电泳表征单抗纯度,采用间接竞争ELISA、Western-blotting、非竞争性ELISA法分别检测单抗效价、特异性及亲和力,结果显示CN、α-LA单抗浓度分别为8.425 mg/m L和8.591mg/m L。抗CN 3D3单抗,抗α-LA 11G10、11F8单抗效价分别为1:256000、1:512000、1:128000。并检测两类单抗亚类均为Ig G1型。酪蛋白、α-乳白蛋白单抗亲和常数分别为0.32×108 L/mol和0.37×108 L/mol。3、金磁(Fe3O4/Au)复合微粒与酶标抗原的制备。采用一锅法制备氨基化的磁性微粒Fe3O4-PEI,之后在其表面包覆两层Au颗粒,制备金磁(Fe3O4/Au)复合微粒,金磁复合微粒形貌呈圆形,粒径均一,粒径约170-185 nm。采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶(HRP)标记CN/α-LA,计算CN-HRP和α-LA-HRP蛋白浓度分别为1.991 mg/m L,2.816 mg/m L;CN-HRP与α-LA-HRP的酶活损失率分别为8.7%、7.63%。4、金磁酶联免疫法检测牛乳过敏原CN/α-LA体系的建立。按照最佳条件制备得到金磁免疫探针和CN/α-LA酶标抗原后,将它们与CN/α-LA标准溶液竞争结合建立金磁酶联免疫检测体系,初步探究了该体系在牛乳中CN/α-LA检测的可行性。研究结果显示CN浓度在4 ng/m L~256 ng/m L范围内,CN浓度对数与抑制率有较好的线性关系,标准曲线为y=32.654x-5.17143,R2=0.993;IC50为50ng/m L,LOD为2.9 ng/m L。α-乳白蛋白浓度在2 ng/m L~256ng/m L检测范围内有较好的线性关系,标准曲线为y=35.718x-2.8429,R2=0.99545;IC50为30.2 ng/m L,LOD为2.3 ng/m L。此外,对该检测体系进行方法学评价,结果显示该方法精密度、特异性、稳定性均较好。CN、α-LA回收率分别在82%~105%和87.1%~111%范围内,满足对CN/α-LA检测的要求。在食品安全检测中有重要的实际应用价值。