研究背景：已知淋巴结转移是影响结直肠癌预后的重要因素之一，而目前的化疗主要是经血道的治疗，即使在药物的血浆峰值浓度，到达淋巴结内的药物浓度也很低。也许这就是部分化疗不敏感的原因。目前已有针对淋巴结转移的淋巴道化疗研究，采用临床常用化疗药如丝裂霉素、5-FU等。这些化疗药均有白细胞毒性，且对淋巴道有刺激作用，只能通过改变药物剂型达到靶向淋巴结、降低毒副作用的目的。笔者认为，理想的淋巴道化疗药物应高度抑制肿瘤细胞而较少伤害淋巴细胞。因此筛选新的高效低毒抗肿瘤药物是本研究的首要目标。研究表明，蟾蜍的化学成分在抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、增强机体免疫功能等方面具有突出作用，因而被用作抗癌治疗。但由于技术限制，目前将蟾衣进行粗提生产药物，通过静脉注射或口服治疗消化道肿瘤，疗效有限且毒副作用大。本研究拟采用新型中药组分分离技术获得蟾皮活性组分群，并进行深入筛选，以期获得高效低毒的有效成分，并建立可行的淋巴道化疗方法，探索治疗结直肠癌淋巴结转移的新策略。研究目的：从蟾皮提取的组分群中筛选高效低毒的抗肿瘤活性组分，建立淋巴道化疗的方法，探讨其在荷人结肠癌裸鼠淋巴道转移模型中，对结肠癌的治疗作用及其对内脏器官和免疫功能的影响。研究方法：1）以蟾皮组分高、中、低浓度（2、0.5、0.1μg/ml）溶液分别与HCT116人结肠腺癌细胞、BGC823人胃腺癌细胞、SW1990人胰腺癌细胞和人CIK细胞进行体外共培养；应用ATP-TCA技术检测不同组分对细胞的作用，筛选对肿瘤细胞抑制率高、对CIK细胞抑制率低的高效低毒活性组分。2）制备蟾皮高效低毒组分不同浓度（2.5、0.25、0.05g/L）的注射乳剂。3）将HCT116细胞接种于BALB/c裸鼠爪垫皮下，建立荷人结肠癌裸鼠爪垫肿瘤淋巴道转移模型。4）将48只荷瘤裸鼠随机分为6组，分别为：生理盐水组，单纯乳剂组，华蟾素注射液组，高、中、低剂量蟾皮组分实验组；各组致瘤第3天开始经爪垫肿瘤周围注射治疗（淋巴道化疗），连续治疗18天，观察裸鼠活力、进食、体重、爪垫肿瘤及淋巴结转移情况；末次治疗后次日处死并完整解剖爪垫肿瘤和腹股沟、髂血管旁、肾门淋巴结；HE染色观察爪垫肿瘤和淋巴结转移情况，计算抑瘤率和淋巴结转移率。5）裸鼠处死前眼眶取血检测血常规和肝肾功能。6）无菌条件下摘取脾脏，称重并计算脾指数；分离并培养脾细胞。7）流式细胞术检测外周血及脾脏中NK细胞和B细胞比例。8）ELISA法检测血清及脾细胞培养上清中IFN-γ和IgG1含量。研究结果：1）HCT116、BGC823和SW1990细胞对蟾皮4~19组分的高、中浓度敏感（抑制率>70%），人CIK细胞对蟾皮1、2、18~22组分的高、中、低浓度均不敏感（抑制率<50%），由此筛选出18、19组分为抗肿瘤高效低毒组分。2）建立荷人结肠癌裸鼠爪垫肿瘤淋巴道转移模型成功率87.5%，致瘤3天爪垫出现肿瘤结节，5天可触及腹股沟区肿大淋巴结，21天可见髂血管旁和肾门肿大淋巴结，转移率分别为62.50%、23.91%和0，6w可见肝转移结节。3）致瘤21天高、中剂量组瘤体积和瘤重小于低剂量组和其它对照组（P<0.05），抑瘤率分别为76.63±11.38%和71.20±17.64%，高于低剂量组、华蟾素组和乳剂组（P<0.05），淋巴结转移率分别为8.33%和9.80%，低于生理盐水组和乳剂组（P<0.05），可见高、中剂量组分明显抑制爪垫肿瘤生长和淋巴结转移，抑瘤作用强于低剂量组分和华蟾素注射液。4）高、中剂量组分明显促进骨髓造血功能并刺激外周血淋巴细胞增殖，作用强于低剂量组分和华蟾素注射液（P<0.05）；高剂量组分可造成肝损伤。5）高、中、低剂量组分和华蟾素注射液均可增加脾指数，中剂量组分作用强于低剂量组分和华蟾素注射液（P<0.05）；6）高、中剂量组分明显刺激外周血和脾脏NK细胞增殖，并促进NK细胞分泌IFN-γ，促进B细胞分泌IgG1。研究结论：1）体外筛选实验证实蟾皮中存在对肿瘤细胞抑制率高，对免疫细胞抑制率低，即高效低毒的抗肿瘤活性组分。2）体内实验证实：从爪垫肿瘤周围注射蟾皮高效低毒组分乳剂，通过爪垫淋巴管进入裸鼠体内淋巴系统，可以明显抑制肿瘤生长和淋巴结转移，活跃造血功能，刺激免疫器官和免疫细胞增生，促进免疫细胞分泌细胞因子和抗体。这种方法具有临床应用前景，如瘤周组织注射，转移淋巴结内灌注，或与微创技术相结合进行肿瘤和腹腔转移淋巴结的局部治疗，可作为治疗结直肠癌淋巴道转移的新方法。