背景长QT综合征（long QT syndrome,LQTs）是一类遗传性的心律失常综合征,其特征为心电图上QT间期延长,T波异常或明显U波,可发展为反复发作的室性心律失常或尖端扭转型室性心动过速,出现晕厥、心脏性猝死等心血管事件。到目前为止,共报道了12种长QT综合征的致病基因,其中8种为离子通道基因,其余为与通道相互作用的蛋白基因。编码心脏快速激活延迟整流钾电流(Ⅰ_kr)通道α亚基的HERG基因（human ether-a-go-go-related gene,HERG）,其突变能通过“功能减弱”机制导致长QT综合征2型（LQT2）的发生,此亚型占所有长QT综合征的45%左右。在目前已发现的300多个HERG突变位点中,错义突变约占62%,无义和移码突变约占30%、码内插入/缺失突变和剪接位点突变等约占8%。既往的研究发现,HERG基因错义突变导致LQT2的最重要分子机制是转运缺陷,且这种转运缺陷可通过低温、HERG通道阻滞剂或其他药物等予以纠正。与错义突变不同,HERG无义突变往往引入提前发生的终止密码子,从而产生毒性的截短的通道蛋白,通过“负显性”机制导致LQT2的发生。HERG基因无义突变能否通过药物纠正目前尚无研究。氨基糖甙类抗生素是一种有潜力的药物,不仅具有杀菌的活性,而且可抑制提前出现的终止密码子,降低翻译的忠实度和准确性,使翻译继续进行从而产生正常的蛋白质,这种现象已在肺囊性纤维化、Duchenne肌发育不良、肾性尿崩症等其他一些无义突变所致疾病中得以证实。大量组织细胞、动物模型及临床试验的研究表明,氨基糖甙类药物能提高无义突变的翻译通过率,部分恢复目的蛋白的表达和/或功能。早在1985年,就有研究报道G-418能恢复无义突变体的表达水平至野生型的25%。庆大霉素作为氨基糖甙类抗生素的一种,不仅目前用于临床一些革兰氏阴性菌感染性疾病,且其对翻译通过率的改善一直显示出较好的效果。目的检测无义突变HERG通道的表达水平;探讨氨基糖甙类抗生素G-418和庆大霉素在异源表达系统中对导致LQT2的无义突变的纯合的HERG通道的作用,分析同一种氨基糖甙类药物对不同突变体作用差异性的原因;阐明HERG基因无义突变致LQT2的发病机制;探讨不同氨基糖甙类药物对杂合的HERG通道的干预效应,评价不同氨基糖甙类药物对某一种HERG通道的作用差异性;检测氨基糖甙类药物对存在转运缺陷的错义突变体是否具有拯救效应。方法采用聚合酶链反应法制备四种HERG C末端无义突变体——R1014X、W927X、R863X和E698X,并克隆到真核细胞表达载体中。将野生型（wild type,WT）HERG和四种无义突变体的质粒扩增、纯化,然后瞬时转染至培养的HEK293细胞,同时共转染绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）基因作为目的基因转染成功的标志物。配制记录HERG通道电流所需的电极内液、外液,设置HERG通道稳态激活的电流一电压关系曲线（Ⅰ-Ⅴ曲线）的刺激参数。在转染了目的质粒36～48h后的HEK293细胞上,应用全细胞膜片钳技术记录通道电流。药物拯救采用将转染24h后的HEK293细胞在含G-418或庆大霉素（终浓度为400μg/ml）的培养基中孵育24h。在膜片钳记录前,换用不含药物的培养基洗脱1h。采用western blot的方法检测野生型和突变的HERG通道蛋白的表达情况,观察突变体是否产生截短的通道蛋白、是否存在转运缺陷等。应用HERG通道N端抗体检测药物干预前通道蛋白的表达,应用HERG通道C端抗体检测药物干预后通道蛋白的表达。制作HEK293细胞爬片,应用共聚焦显微镜定性检测野生型和突变的HERG通道蛋白在细胞膜和细胞浆内的分布情况,观察突变体是否会产生免疫荧光、荧光主要分布在胞膜还是胞浆等。应用HERG通道N端抗体检测药物干预前突变通道蛋白的细胞内分布,应用HERG通道C端抗体检测药物干预后突变通道蛋白的细胞内分布。结果1、HEK293细胞表达模型的建立:HEK293细胞经连续传代培养后,贴壁生长良好,呈多边形类上皮细胞样。在细胞转染前一天,将培养瓶中的细胞用胰酶消化,接种约1×10⁵细胞于35mm培养皿。当细胞贴壁生长融合50%～70%时,进行转染。转染后36～48小时在荧光显微镜下观察,瞬时转染效率约为50%～60%,转染阳性的HEK293细胞带绿色荧光,未转染的细胞不带绿色荧光。挑选带绿色荧光、边缘清楚、表面光滑、大小适中的细胞进行全细胞膜片钳记录。2、无义突变HERG通道的电流表达:野生型HERG通道表现出典型的电压依赖性激活和内向整流特性,其最大尾电流密度为47.8±6.3 pA/pF（n=12）。R1014X和W927X突变体均能表达典型的HERG样电流,但与野生型HERG通道相比,最大尾电流密度明显下降（R1014X:3.9±1.4 pA/pF,n=8,P<0.01;W927X:11.6±2.4 pA/pF,n=8,P<0.01）。R863X和E698X突变体仅表达与未转染的HEK293细胞上类似的内生性电流,在至少8个细胞上均未记录到尾电流,说明二者并不能形成功能性的HERG通道。3、氨基糖甙类药物对纯合突变的HERG通道的干预效应:氨基糖甙类药物能增强R1014X和W927X的电流表达,使其尾电流幅值明显增加。经过400μg/mlG-418和庆大霉素干预后,R1014X突变体的最大尾电流密度分别增加至12.7±3.3 pA/pF（n=7,P<0.05）和18.3±3.7 pA/pF（n=8,P<0.05）。与野生型HERG通道相比,R1014X的激活曲线左移,通道的半激活电压更负;药物干预后,其激活动力学特性亦得到恢复。庆大霉素干预对W927X亦有效,其最大尾电流密度增至19.5±2.7 pA/pF（n=7,P<0.05）。通道激活动力学特征在野生型HERG、W927X和W927X加庆大霉素干预组均没有明显差异。然而,庆大霉素干预对R863X和E698X突变体并无明显作用,仍然未能汜录到尾电流,仅表达内生性电流。4、无义突变通道蛋白的表达及其在细胞内的分布形式:野生型HERG通道表达两个蛋白条带约在135KDa和155KDa处,分别代表经过核心糖基化后的未成熟蛋白和经过复合糖基化后的成熟蛋白形式。R1014X突变体经抗HERG通道N端抗体检测,显示两个蛋白条带约在120KDa和140KDa处,说明无义突变产生了截短的通道蛋白。R863X突变体则仅显示一个蛋白条带约在90KDa处,说明R863X不仅产生了截短的通道蛋白,同时还存在转运缺陷。为了检测野生型和突变通道蛋白的细胞内分布形式,应用HERG通道N端抗体进行共聚焦免疫荧光实验。未转染质粒的HEK293细胞上,无任何可见的荧光。转染了野生型HERG通道的HEK293细胞,可见到强烈的红色荧光,主要分布在细胞膜上,部分位于细胞浆内。在转染R1014X和W927X的HEK293细胞上,也可见到分布在细胞膜和胞浆内的红色荧光;转染R863X和E698X的HEK293细胞,荧光几乎分布在胞浆内。5、氨基糖甙类药物对无义突变HERG通道蛋白的影响:应用HERG通道C端抗体检测药物干预的效果。野生型HERG通道仍表达135KDa和155KDa两个蛋白条带,而R1014x并未显示任何条带。经G-418和庆大霉素干预后,出现与野生型通道蛋白位置一致的两个蛋白条带,说明氨基糖甙类药物诱导了全长的有功能的通道蛋白的表达。而庆大霉素对存在转运障碍的错义突变体N470D并无明显作用,说明氨基糖甙类药物并不能纠正转运缺陷。以HERG通道C端抗体检测药物对突变体通道蛋白在细胞内的分布形式的影响。未转染细胞上不能检测到任何荧光,转染了野生型HERG质粒的细胞可见到分布在细胞膜和胞浆内的红色荧光信号。与未转染的细胞相似,单独表达R1014X突变体的细胞上也无可见的荧光;而庆大霉素处理后的细胞则能表达红色荧光,说明其存在全长的通道蛋白,否则将不能被C端抗体检测到。表达R863X突变体的细胞,在药物干预前后,均无可见的荧光。以上结果与western blot的结果一致。6、氨基糖甙类药物对负显性抑制的干预效应:鉴于LQT2呈常染色体显性遗传,患者的基因型往往为正常和突变等位基因共存的杂合子,因此进一步对杂合通道（WT/R1014X）进行检测。WT/R1014X通道的最大尾电流密度为13.1±2.2pA/pF（n=8）,低于野生型HERG通道的50%,说明R1014X对野生型HERG通道存在负显性抑制效应。为了验证氨基糖甙类药物是否能消除此负显性效应,以400μg/ml G-418和庆大霉素干预WT/R1014x通道。G-418和庆大霉素对杂合的WT/R1014X通道作用效应不同:庆大霉素能使WT/R1014X的最大尾电流密度增加2.2倍（29.2±3.7 pA/pF,n=12,P<0.05）,G-418却无明显效应（13.7±1.8pA/pF,n=8,P>0.05）。WT/R1014X通道的激活动力学特征与野生型HERG相比无明显差异,药物干预对其亦无明显影响。结论1、HERG通道C术端无义突变体是否能表达功能性的通道电流,取决于其从C末端截短的氨基酸残基的多少。2、氨基糖甙类药物能增强纯合的HERG通道无义突变的功能性表达,恢复其通道的电生理特性。3、氨基糖甙类药物能抑制提前出现的终止密码子,使翻译继续进行,恢复全长的有正常功能的HERG通道蛋白的表达。4、氨基糖甙类药物能消除突变体的负显性抑制效应,增强杂合的HERG通道的功能性表达。