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柑橘类水果是全球第一大水果,在世界范围内广泛种植,有近140个国家生产柑橘,年产量达1亿吨。我国是柑橘产销大国,2016年的种植面积约260万公顷,柑橘产量约3600万吨。然而,由黄龙病菌(Candidatus liberibacter asiaticus,CLas)引发的柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)给我国乃至全球柑橘产业带来了致命威胁,经过木虱传播,能够侵染几乎所有的柑橘及其近缘属植物,引起叶片黄化,果实着色异常、果小、畸形等症状。生产上,主要采用使用无病苗、铲除病株和防控柑橘木虱的综合防控方法进行柑橘黄龙病的田间防治。木虱防控主要是化学防控,大量化学农药的使用给环境和生态带来了巨大压力。由于当前的柑橘主栽品种无抗病性,已评价的柑橘资源有耐病性但无抗病资源,以主栽品种为亲本的杂交育种很难获得抗病或高耐病的后代。因此,通过筛选响应柑橘黄龙病的基因并进行遗传转化,可能是抗黄龙病育种的有效途径。理论上,植物遭受病原菌侵害时,植物会运用自身的多种防御机制,比如包括病原物相关分子模式触发的免疫反应(PAMPs-triggered immunity,PTI)和效应子触发的免疫反应(Effector-triggered immunity,ETI),抵御病原菌的入侵。当病原菌分泌的效应子抑制PTI,会激活促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联反应和病程相关基因,特异性R蛋白引发ETI抵御病害。MAPK级联反应由3种蛋白激酶组成,MAPK是末端信号。病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRP)是植物抵抗病原菌入侵时参与防卫反应的一类蛋白质。近年来,已有大量关于遗传转化MAPK基因和PR基因提高植物抗性的报道,柑橘MAPK基因和PR基因如何响应黄龙病菌的入侵和是否参与抗病反应需要深入研究。本论文以埃及糖橙(Citrus sinensis(L.)Osbeck)为试验材料,以MAPK基因及PR基因为研究对象,筛选响应柑橘黄龙病的基因,构建过表达载体并获得转基因植株。试验主要结果如下:1、感染柑橘黄龙病植株和未染病植株的鉴定。提取糖橙叶片基因组DNA,通过PCR检测,筛选4株染病植株和4株未染病植株进行后续试验。2、引物设计。利用NCBI网站上已公布的柑橘基因组数据和EST数据,从柑橘cDNA文库中成功克隆15个MAPK基因,包括CsMAP、CsMAP1、CsMAP4-like、CsMAP7、CsMAP7-like、CsMAP9、CsMAP9-like、CsMAP13-like、CsMAP15、CsMAP19-like、CsMAP20-like、CsMAPMMK1、CsMAPMMK2、CsMAPNTF3及CsMAPKB1;17个PR基因,包括CsPR1、CsPR2、CsPR3、CsPR4、CsPR5、CsPR6、CsPR7、CsPR8、CsPR9、CsPR10、CsPR11、CsPR12、CsPR13、CsPR14、CsPR15、CsPR16及CsPR17。3、鉴定响应柑橘黄龙病的基因。实时荧光定量PCR结果显示,CsMAP9基因在染病植株的相对表达量约为未染病植株的1.7倍,CsMAP9-like基因在染病植株的相对表达量约为未染病植株的1.8倍;与未染病植株相比,CsPR12和CsPR14基因在染病植株中相对表达量显著升高,分别上调约1.9倍和6.7倍;其他基因的相对表达量差异不显著。综上,基因表达量在染病植株中显著上调的CsMAP9、CsMAP9-like、CsPR12和CsPR14基因,可能在柑橘寄主抵抗HLB中发挥了重要作用。我们选取这四个基因进行遗传转化。4、候选基因的克隆与转化。采用PCR-酶切连接法构建过表达载体。扩增CsMAP9、CsMAP9-like、CsPR12和CsPR14基因的CDS片段,连接到pFGC5941载体,通过冻融法成功将重组质粒转入根癌农杆菌EHA105。5、转基因植株的鉴定。利用pFGC5941载体上的抗除草剂Basta基因作为筛选标记,PCR检测获得带有标记基因的CsMAP9转基因植株12株,CsMAP9-like转基因植株15株,CsPR12转基因植株11株和CsPR14转基因植株14株。qRT-PCR检测阳性植株基因表达水平,获得过表达CsMAP9植株2株,CsMAP9-2和CsMAP9-25;过表达CsMAP9-like植株3株,CsMAP9-like-8、CsMAP9-like-11和CsMAP9-like-22;过表达CsPR12植株2株,CsPR12-15和CsPR12-26;过表达CsPR14植株2株,CsPR14-17和CsPR14-26。将转基因幼芽进行嫁接以获得更多转基因后代,为进一步探索这些基因在抗柑橘黄龙病的作用提供材料。