论文部分内容阅读
产肠毒素性大肠杆菌(简称ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原之一。在家畜中，尤以初生幼畜易感，引起生长发育迟缓，生产能力低下，甚至造成死亡，给畜牧业造成极大损失。肠毒素和黏附素是ETEC的两大致病因子，而耐热性肠毒素STI又是肠毒素中最主要和最直接的致病因子。本研究利用PCR和基因定点突变技术构建了4种含有STI突变体基因的重组表达质粒pES(S)LK、pES(G)LK、pE3S(S)LK和pE3S(G)LK及相应的重组菌株，进行诱导培养，通过乳鼠灌胃实验检测重组蛋白生物学毒性，并以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA方法，对重组蛋白免疫抗体水平进行了检测。本研究为有效防治仔猪大肠杆菌性腹泻提供基础材料和理论支持，为研制新的高效的大肠杆菌多价基因工程疫苗奠定了较为坚实的基础。
实验结果如下：
1.通过PCR和基因定点突变技术将STI毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly，成功构建了重组表达质粒pES(S)LK、pES(G)LK及两株基因工程菌株BL21(DE3)(pES(S)LK)、BL21(DE3)(pES(G)LK):SDS-PAGE和Western blotting分析表明，两种重组菌株所表达的ST I(S)-K99和ST I(G)-K99重组蛋白分别占菌体总蛋白相对含量的22.8％和30.9％，且能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性，结果均为阴性(G/C值≤0.083)，表明重组菌株已无ST I生物学毒性。
2.通过PCR技术及基因重组技术，成功构建了含有3个ST I突变体基因的重组表达质粒pE3S(S)LK、pE3S(G)LK及其重组菌株BL21(DE3)(pE3S(S)LK)、BL21(DE3)(pE3S(G)LK)。SDS-PAGE和Western blotting分析表明，以上两种重组菌株所表达的3ST I(S)-K99和3ST I(G)-K99重组蛋白，分别占菌体蛋白相对含量的21.4％和21.9％，且能够被产肠毒索性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别。利用乳鼠灌胃实验检测重组蛋白的生物学毒性，结果均为阴性(G/C值≤0.083)，这表明该菌株已无ST I生物学毒性。
3.对重组蛋白3ST I(S)-K99和3ST I(G)-K99进行了初步纯化，作为抗原包被ELISA板，初步建立了一套检测重组蛋白免疫抗体水平的间接ELISA方法。
4.利用所建立的ELISA方法对重组蛋白免疫结果进行了检测，发现以0.8mg的重组蛋白抗原量每两周免疫一次家兔，2周后既能产生较高水平的抗体，其中尤以3ST I(G)-K99融合蛋白免疫产生的抗体水平最为显著。
本研究成功构建了四株大肠杆菌基因工程菌株，并对其表达产物做了较为详尽的研究，为有效防治仔猪大肠杆菌性腹泻提供基础材料和理论支持，为研制新的高效的大肠杆菌多价基因工程疫苗奠定了较为坚实的基础。