论文部分内容阅读
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,由于发病隐匿、恶性程度高、发 展迅速,因此治疗困难。目前肝癌治疗中,外科手术切除仍是首选方案,但疗效 并不理想。基因治疗是近年来兴起的一种新的治疗热点,被认为是治疗恶性肿瘤 最有希望的治疗方案之一。Fit3L是新近发现的早期造血生长因子,具有刺激机 体造血和增强机体免疫功能的双重作用。本研究课题以逆转录病毒载体介导,将 目的基因Fit3L导入小鼠肝癌细胞系Hepal-6,研究其生物学行为的变化,为临 床上开展肝癌的基因治疗提供必要的基础理论资料。 本研究 1、应用基因表达的逆转录病毒载体pBabe Puro构建一个携带小鼠 Flt3L的逆转录病毒载体pBabe/FlteL。将其转染单嗜性逆转录病毒包装细胞株 ψ-cre,其病毒上清转染双嗜性逆转录病毒细胞株ψ-crip,经嘌呤霉素筛选4 周,单克隆化,用 NIH3T3检测,其最高病毒滴度为 2.0 X 106CFU/ml,命名为ψ一crip/Flt3L。2、上清感染法将目的某因导入小鼠肝癌 Hepal-6细胞系.经嘌 呤霉素选择培养得到携带目的基因的细胞克隆,命名为Hepl-6/Flt3L。RT-PCR 证实目的基因mRNA在靶细胞中能有效转录;免疫组化证实其表达Fit3L蛋白; ELISA检测其上清Flt3L 蛋白的分泌量为11.5ng/106/48小时。3、动物实验结 果表明,虽然导入Flt3L基因后,并不影响Hepal-6肝癌细胞体外生长,但却能 使其体内成瘤性明显降低,提高了肿瘤细胞的免疫原性;将其作为瘤苗接种于小 鼠皮下,能激发特异性免疫保护反应,保护 100%(6/6)的小鼠免于对侧 Hepal-6 的再次攻击,而对照组为0%(0/6);在微小肿瘤治疗方面,于接种Hepal-6/Flt3L 或 Hepal-6/pBabe前 5天,于小鼠对侧皮下接种野生型 Hepal-6细胞,4周后 Hepal-6/Flt3L可使对侧 80%的肿瘤消退(8/10),而 Hepal-6/pBabe则不能使对侧肿瘤消退;肿瘤组织冻切片免疫组织化学显示Flt3L引起肿瘤局部炎细胞的显 著浸润,CD4+、CD8+细胞明显多于对照组。