哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路整合来自细胞内外的各种信号,对细胞的代谢、生长增殖及存活等生理过程发挥着中心调节作用。许多人类疾病,如癌症和2型糖尿病中都发现mTOR信号通路的调节发生异常。近年来,mTOR信号通路成为基础和临床研究的热点。mTOR蛋白激酶活性的发挥有赖于其在细胞内与其他分子结合形成复合物：mTOR复合物1 (mTOR complex1, mTORC1)和mTORC2。大环内酯类药物雷帕霉素与细胞内蛋白分子即FK506-结合蛋白12 (FK506-binding protein 12, FKBP12)结合后,对mTORC1发挥特异性的抑制作用。接受生长因子及胰岛素等信号刺激而活化的PI3-K/Akt(蛋白激酶B,PKB),能够磷酸化结节性硬化复合物2(tuberous sclerosis complex 2, TSC2),从而减弱后者对mTORC1的抑制作用。活化的mTORC1可以直接磷酸化其下游底物,40S核糖体蛋白S6激酶(40Sribosomal protein S6 kinase1, S6K1)和真核细胞翻译起始因子4E-结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1,4E-BP1)。S6K1Thr389位点磷酸化后使其激后,并磷酸化核糖体蛋白S6,从而启动5’-Top mRNA (5’-terminal oligopyrimidine tract mRNA)的翻译。被mTORC1磷酸化的4E-BP1则不能再与eIF-4E结合,从而启动5’-帽结构依赖性(5’-cap-dependent)的蛋白翻译。由此二者共同促进蛋白质翻译。S6Ks属于AGC丝／苏蛋白质激酶家族。哺乳动物细胞主要表达该激酶的两种分子,即S6K1和S6K2(又分别称为S6Kα和S6Kβ),它们由不同的基因编码,但全序列具有很高程度的同源性。S6K1有两种亚型,这两种亚型是由同一个转录子(mRNA)通过选择不同的翻译起始位点而得到的不同产物。p70 S6K1,主要分布于细胞质中；p85 S6K1的N-端较p70 S6K1多了一段由23个氨基酸残基构成的核定位信号(nuclear localization signal, NLS),主要分布于细胞核内。S6K1是mTORC1最主要的效应分子之一,其调节方式常被作为研究mTORC1信号通路的模型。虽然S6K1的完全及持续活化需要多个生长因子诱导的磷酸化反应,Thr389位点的磷酸化对于S6K1的活化尤其重要,有研究证明,用丙氨酸替代该位点的苏氨酸能阻断S6K1激酶结构域的活化。体外实验证明,mTORC1可以直接磷酸化p70 S6K1的Thr389,而经雷帕霉素处理的细胞,S6K1的Thr389位点发生快速去磷酸化从而使S6K1失活。最近大量研究报道了S6Ks在调节细胞大小、肿瘤侵袭、迁移以及血管生成、胰岛素抵抗及寿命等生理病理进程中发挥了重要作用。然而,上游信号是如何调节S6Ks以及S6Ks通过何种方式调节细胞的生理过程还没有完全阐明。由于目前还没有能快速抑制S6Ks活性的S6K1或S6K2特异性抑制剂,现有的关于S6Ks活性抑制效应研究的大部分结果,主要通过雷帕霉素抑制mTORC1而间接抑制SK6s的功能而得到。但新近报道,S6K1能通过雷帕霉素抵抗及mTORC1非依赖性的方式发生活化。而且,雷帕霉素及其类似物治疗肿瘤时,常发生雷帕霉素抵抗,其机制还不明确。因此,阐明S6Ks的mTORC1非依赖性活化机制对进一步明确S6Ks功能及其在人类疾病中的作用具有重要的意义。目前普遍认为S6K1两种亚型,即p70 S6K1和p85 S6K1的调控机制与功能是相同的,所以多数研究主要是针对细胞质亚型的p70 S6K1,而细胞核亚型p85S6K1的功能其及调控机制被忽略,因此对于p85 S6K1的功能及调控机制鲜有报道。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)在肿瘤形成和肿瘤进展中发挥重要作用。最近研究发现,TNF-α和ROS是mTORC1和p70 S6K1的上游信号分子,TNF-α可通过IκB激酶(IκB Kinase, IKK)磷酸化并抑制TSC1,从而激活mTORC1与p70 S6K1, ROS可通过尚不清楚的机制激活或抑制mTORC1和p70 S6K1,但它们对p85 S6K1的调控及其机制还未见报道。在本研究中,我们发现p85 S6K1和p70 S6K1具有新的、不同的调节机制与功能。我们首次证明,TNF-α和H2O2磷酸化激活p85 S6K1(T412)是雷帕霉素非依赖的,而对p70 S6K1(T389)的活化却可被雷帕霉素抑制,且这种活化作用不需要mTOR(mTORC1/2),但依赖于IKK。一、mTOR sh RNA, p70 S6K1和p85 S6K1真核表达载体的构建及谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase, GST)-S6蛋白的制备(1)利用PCR技术,将69 bp(23个氨基酸)加到大鼠p70 S6K1 cDNA的N-末端,扩增得到p85 S6K1的cDNA将p70/p85 S6K1的cDNA克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,成功构建pcDNA3.1-Flag-p70 S6K1和pcDNA3.1-Flag-p85 S6K1真核表达载体。为了防止在p85 S6K1表达载体翻译出p70 S6K1蛋白,我们将p70 S6K1翻译起始位点的ATG (70-72th bp)突变为TTG。(2)GST-S6蛋白的制备提取人胚胎肾细胞293 (human embryonic kidney 293, HEK293)的总mRNA作为模板,通过RT-PCR获得人40S核糖体蛋白S6 cDNA,将其克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,命名为pGEX-6P-1-S6。GST-S6融合蛋白经异丙基β-D-1-半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达后,利用GST-琼脂糖beads进行纯化。纯化的蛋白将作为S6K1体外激酶活性检测的底物。(3)构建重组mTOR sh RNA表达载体(psiLV-H1-mTOR)成功构建mTOR sh RNA表达载体(psiLV-H1-mTOR),在脂质体的介导下转染人乳腺癌细胞系MCF-7。转染72-96h后可见内源性mTOR的表达明显下调。二、TNF-α和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)以mTOR非依赖,IKK依赖的方式激活p85 S6K1,但不激活p70 S6K1(1)p70 S6K1和p85 S6K1对TNF-α及H2O2刺激产生不同反应现有的研究证明,细胞内外各种信号诱导的S6K1(T389/412)和S6(S235/236)的磷酸化反应对雷帕霉素敏感。我们的实验结果显示,在MCF-7细胞中,加入100 nM的雷帕霉素,可以阻断胰岛素及氨基酸诱导的p70 S6K1(T389)、p85 S6K1(T412)和S6(S235/236)的磷酸化。然而,雷帕霉素能抑制TNF-α和HzO2刺激后MCF-7细胞的p70 S6K1的磷酸化,但对p85 S6K1的磷酸化却没有抑制作用。与p85 S6K1(T412)的这种对雷帕霉素不敏感的磷酸化结果一致的是,在有雷帕霉素的作用下,TNF-α和H2O2也能使S6(S235/236)的磷酸化水平增加。而且,H2O2使多种细胞(人骨肉瘤细胞系MG63,小鼠原代成骨细胞OB,乳腺癌细胞系MCF-7和人结肠癌细胞系HCT116的p85 S6K1(T412)发生磷酸化的同时,却抑制p70 S6K1(T389)的磷酸化。以上结果提示,p70 S6K1和p85 S6K1对某些上游信号(如H2O2和TNF-α)存在完全不同的反应。(2)H2O2以不依赖于雷帕霉素和氨基酸的方式引起p85 S6K1(T412)磷酸化,但不能引起p70 S6K1(T389)的磷酸化现有研究表明,氨基酸饥饿和雷帕霉素能抑制多种上游信号对mTORC1的活化。我们发现MCF-7, HeLa和HCT116细胞在有雷帕霉素或者氨基酸饥饿的情况下,H2O2能诱导内源性的p85 S6K1(T412)发生磷酸化,但不能诱导p70S6K1(T389)发生磷酸化。而且,H2O2也能使过表达的Flag-p85 S6K1 (T412)发生磷酸化,这种作用对雷帕霉素不敏感。但H2O2不能诱导过表达的Flag-p70S6K1(T389)发生雷帕霉素非依赖磷酸化。(3)H2O2和TNF-α引起雷帕霉素非依赖的p85 S6K1激活参与雷帕霉素存在时S6(S235/236)的磷酸化激活S6的S235/236位点的磷酸化对其自身的活化非常关键。我们发现,MCF-7和HCT116细胞中,在有雷帕霉素的情况下,H2O2和TNF-α也能激活S6(S235/236)。过表达的Flag-p85 S6K1而非Flag-p70 S6K1能增强这种雷帕霉素非依赖的S6(S235/236)磷酸化。更重要的是,体外激酶反应结果显示,免疫纯化的Flag-p85 S6K1而不是Flag-p70 S6K1,负责H202引起的S6(S235/236)雷帕霉素非依赖的磷酸化。以上结果提示,是p85 S6K1而非p70 S6K1与雷帕霉素非依赖的S6活化有关。(4) mTOR (mTORCl和mTORC2)与H2O2引起的p85 S6K1雷帕霉素非依赖的活化无关利用sh RNA敲低内源性mTOR的表达,使内源性p70/p85 S6K1(T389/412)和S6(S235-36)的磷酸化下降,但不能抑制H2O2诱导的p85 S6K1(T412)和S6(S235/236)的磷酸化。因此,mTOR与H2O2引起的p85 S6K1、S6雷帕霉素非依赖的活化无关。(5)TSC2不参与H2O2激活p85 S6K1IKK-β通过磷酸化TSC1作用于mTORC1的上游负性调控分子TSC1/2复合物,激活mTORC1及S6K1。我们选用TSC2野生型及敲除型的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast, MEF)系TSC2+/+P53-/-MEF和TSC2-/-P53-/-MEF,发现两种细胞在H2O2的作用下,均出现了p85 S6K1(T412)磷酸化水平的增加。而且,有雷帕霉素存在时,两种细胞中均出现剂量效应的p85 S6K1(T412)被H2O2激活,而p70 S6K(T389)被完全抑制,因此,H2O2引起p85 S6K1雷帕霉素非依赖的磷酸化与TSC2无关。(6)IKK参与H2O2引起的不依赖nTOR的p85 S6K1和S6活化为进一步研究参与这种不依赖mTOR的p85 S6K1和S6活化的上游信号通路,我们用P13-K和IKK特异性抑制剂进行干预。结果发现,IKK抑制剂能够阻断H2O2诱导的p85 S6K1 (T412)和S6(S235/236)发生的磷酸化,但是PI3-K抑制剂和mTOR抑制剂对它们的磷酸化则没有抑制作用。我们又进一步证明,过表达的myc-IKK-β与Flag-p85 S6K1之间存在相互作用,而且H2O2能增强这种作用。这些结果表明,IKK参与了H2O2诱导的p85 S6K1和S6不依赖nTOR的活化。综上所述,我们的研究结果揭示了一种新的S6K1调控机制。雷帕霉素存在时,H2O2和TNF-α能激活p85 S6K1但不能激活p70 S6K1,这种激活作用不依赖于mTOR,但是依赖于IKK信号通路,而且这种激活作用负责S6(S235/236)的雷帕霉素及mTOR非依赖性活化。这些发现将有助于我们进一步阐明p85S6K1的功能和雷帕霉素及其类似物治疗肿瘤时形成雷帕霉素抵抗的机制,为发展新的基于mTOR通路的肿瘤靶向治疗方案提供理论基础。