微核试验是常用的一种以染色体丢失和断裂为遗传学终点的细胞遗传学方法,其常用于研究外源化学物的细胞遗传毒性,并结合着丝粒免疫荧光标记技术分析外源化学物遗传毒作用机制的类别。由于动物福利伦理的要求和动物试验的“3R”原则(优化、减少、替代),体外微核试验逐渐成为化学物遗传毒作用的一个重要的初筛试验方法。体外微核试验目前常用的模型是人类淋巴细胞微核试验和哺乳动物细胞系微核试验；前者优点是靶细胞由人类来源,后者属永生化细胞,增殖能力强、核型稳定、试验重现性佳。采用永生化哺乳动物细胞系的微核试验的标准程序包括如下暴露/恢复时程：受试细胞短时暴露(≤0.5个细胞周期)于受试化合物,继以较长恢复时间(≥1.5个细胞周期)；若结果为阴性或可疑阳性,则进行第二个程序的试验；延长暴露时间(≥2个细胞周期)至细胞收获(无恢复时间)。这样包括两个试验程序的方案可最大限度减少细胞遗传毒物漏检(假阴性)的几率。已有报道,第一、第二个试验程序分别有利于检测断裂剂和致非整倍体剂。许多重要的环境致突变物、致癌物须经生物转化酶代谢活化后才能发挥其遗传毒作用,所以体外微核试验中包括添加代谢活化系统以弥补标准测试细胞中生物转化酶活性缺失的试验。经典的外源性代谢活化体系是由酶诱导剂Aroclor 1254处理的大鼠制备的肝微粒体与体外NADPH再生系统构成的代谢活化体系(S9混合液),常用于化学物的体外遗传毒性试验中。然而,S9混合液缺乏细胞色素P450 (CYP) 1B1和CYP2E1以及参与大量致癌物生物活化的多种非CYP酶系,对于一些需此类酶系活化的间接致突变物的检测并不适用；S9混合液也有酶活性不稳定和致细胞脂质过氧化改变等缺点,所以,S9在体外微核试验中暴露时间受限。为克服S9混合液的不足,在遗传毒性机制研究中可使用表达人类生物转化酶的细胞系来代替细胞外代谢活化系统。为了印证文献报道的断裂剂和致非整倍体剂对染毒时程的不同选择性。本课题的第一部分是采用已知的染色体断裂剂(丝裂霉素C和博来霉素)和致非整倍体剂(秋水仙碱和长春花碱)对中国地鼠肺成纤维(V79)细胞染毒,染毒方案分别采取以下不同暴露／恢复时程：0h／24h(阴性对照)、3h/21h、6h/18h、 12h/12h、18h/6h和24h／0h,然后检测各组微核细胞率。然而,重组表达生物转化酶的受试细胞对间接致突变物的代谢活化是一个可能出现酶蛋白饱和现象及需要时间的过程,其是否影响暴露／恢复时程与所测试受试物微核形成机制的特定关系则尚无报道。本课题的第二部分则使用共表达人CYP2E1酶和人硫酸基转移酶(SULT) 1A1酶的重组中国地鼠肺成纤维(V79)细胞(V79-hCYP2E1-hSULT1A1)来初步探讨数种需生物转化酶代谢活化的外源化学物的遗传毒作用机制。其中,卜甲基芘经CYP2E1酶和SULT1A1酶先后两步生物转化反应而活化,1-羟甲基芘经SULT1A1酶活化形成致突变物(二者未经代谢活化均无遗传毒性)；氢醌、儿茶酚和1,2,4-三羟基苯则被CYP2E1酶活化成活性增强的致突变物。微核试验方法同以上第一部分,探讨暴露／恢复时程对这些受试物诱发微核作用的影响,此外还分析各受试物诱导细胞有丝分裂阻滞的作用(作为微管毒性的标志),为判断受试物可能的遗传毒作用机制(断裂剂或致非整倍体剂)提供线索。多氯联苯(Polychlorinated biphenyls, PCBs)是一组持久性有机污染物,至今仍普遍存在于全球环境中,且在高暴露人群体内有一定量的蓄积。2013年国际癌症研究机构(IARC)己把PCBs确认为人类致癌物。CYP2E1是一个主要在肝脏表达的重要生物转化酶,可催化许多小分子外源化学物的代谢,包括苯、苯酚及某些短链卤代脂肪烃等化学物。本课题组以微核试验和1Hpγt基因突变试验为遗传学终点的前期研究发现,低氯化多氯联苯经人CYP2E1代谢活化成为具有遗传毒性的代谢物,其作用明显强于另外几个CYP酶。小鼠是一个毒理学试验中常用的动物种属,但是小鼠CYP2E1酶对PCBs的代谢活化作用未见报道。为进一步探讨CYP2E1酶对PCBs代谢活化能力的种属差异性,本课题选取前期研究中以不同(递减)强度诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞微核形成的4种PCB化合物(PCB 20、PCB 18、PCB 5和PCB 28),N-亚硝基二甲基胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA,依赖于CYP2E1活化的强致突变物)作为参考性己知间接致突变物探讨这5种化学物诱发表达小鼠CYP2E1酶的V79重组细胞(V79-mCYP2E1)和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞Hprt基因座突变作用,比较两个种属CYP2E1酶代谢活化作用的选择性和活化强度的差异,以期为相关动物试验的物种选择提供依据。目的1.印证不同外源化学物诱发哺乳动物细胞微核形成所需敏感的暴露／恢复时程与微核形成机制(断裂作用与致非整倍体作用)之间的关系。2.研究需经生物转化酶代谢活化的几个外源化学物在不同暴露／恢复时程条件下诱导重组表达生物转化酶的哺乳动物细胞系微核的作用,从而明确代谢环节是否构成对微核形成的时程毒理学的影响,以及相关间接遗传毒物作用的可能机制。3.探讨人和小鼠两个种属的CYP2E1酶分别对NDMA和4种PCBs诱发基因突变的作用,以阐明这两个种属的CYP2E1对PCBs代谢活化作用的相似度或差异性。方法1.细胞增殖／存活测定(CCK-8试验)CCK-8试验方法是测定细胞增殖和活性的常用方法。CCK-8试剂含有WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),其在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鲔硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazandye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比,通过酶标仪于450nm处测定光密度(Optical density, OD)而定量。本研究中以各受试物处理V79和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞的暴露／恢复时程按照以下方案进行：0h／24h(阴性对照),3h/21h,6h/18h,12h/12h,18h/6h和24h／0h。加入CCK-8试剂后用酶标仪于450nm波长检测溶液光密度,以各暴露组与对照组光密度的比较表示细胞增殖／存活率。2.微核试验微核试验是检查细胞染色体可遗传改变的一种遗传毒性试验方法。V79细胞和V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞接种24h后进行染毒,暴露／恢复时程与CCK-8试验方法相符。选择受试化合物浓度的原则：多数暴露／恢复时程条件下微核细胞率增高具有统计学意义,同时细胞毒作用尽量低或完全没有；每个受试物设置2个相差一倍的浓度。对于受试物可被SULT1A1代谢减毒(氢醌、儿茶酚及三羟基苯)的试验,V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞以SULT1抑制剂五氯酚(PCP)处理(染毒前2h加入并一直存在于培养液中,直至细胞收获)。各培养瓶中的细胞以胰蛋白酶消化的方式收获,经过低渗、固定、滴片,最后用姬姆萨染液染色。每个处理组设2个重复试验,在光学显微镜油镜下每个试验随机观察1000个完整细胞,计数至少含一个微核的细胞数,以获得微核细胞率。3.有丝分裂细胞率的分析细胞纺锤体损伤的一个突出表现就是有丝分裂阻滞,即细胞增殖不受明显影响的情况下出现的细胞有丝分裂频率增高。细胞接种于放置4.5cm2圆形爬片的6孔板中,于24h染毒,受试物为氢醌、儿茶酚或三羟基苯时1CP(10μM)于染毒前2h加入,直至染毒结束。细胞经固定,以姬姆萨染色液染色,然后将爬片倒扣于载玻片。每组设置2个重复样本。光学显微镜油镜下每个试验随机观察1000个完整细胞,计数有丝分裂期细胞并计算其所占比例,即有丝分裂细胞率。4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western Blot)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹是蛋白质电泳分离和定量分析的常用方法。实验流程如下：制备蛋白样品(BCA法测蛋白浓度)、SDS-PAGE(上样量为50μg蛋白质、容量1mL)、电转移(冰浴转膜)、封闭、一抗孵育(4℃)、TBST洗涤、二抗孵育(常温)、TBST洗涤、电化学显色反应、分析。5. Hprt基因座致突变试验细胞在Hprt(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)位点的正向突变(即获得对6-巯基嘌呤的抗性)是其所观察的遗传毒作用终点。细胞以1.5×106个/瓶(182cm2,25mL培养液)的密度接种,24h后,加入各受试化合物,染毒24h后换液。继续培养2d后,以胰蛋白酶消化收集细胞(各组细胞数占对照组细胞数的百分比作为受试物细胞毒性的指标)后以1×106个/皿(137cm2,25mL培养液)密度传代。进一步培养3d后,再一次传代并以5×105个/皿的密度接种细胞于含有6-巯基嘌呤(7μg/mL)的选择性培养液(每个培养皿收集的细胞传代于含选择性培养液的4个培养皿)；另外以100个/皿的密度接种细胞于3个含正常培养液的9.6 cm2培养皿,以测定细胞的集落形成率。8d后试验终止,经固定和姬姆萨染色,计数每个培养皿细胞集落的数目,以平行接种的各培养皿所得均数作为相应的观察值(集落形成率和突变细胞率)。6.统计学分析CCK-8试验采用方差分析法对不同处理组与对照组进行统计学检验。微核试验和有丝分裂细胞率分析试验中每个处理组设有2个重复测试,组内数据合并后采用χ2检验对不同处理组进行统计学检验。Hprt基因突变试验中各处理组与对照组突变细胞率的比较采用Fisher确切概率法。所有统计结果以P<0.05判断为差异有统计学意义。结果1.断裂剂丝裂霉素C (MMC)和博莱霉素(BLM)诱发V79细胞微核的作用随暴露／恢复时程变化呈现双相反应：首先随着暴露时间延长微核细胞率逐渐增高,于12h／12h达到峰值,然后逐渐下降。而致非整倍体剂秋水仙素(COL)和长春花碱(VBL)诱发微核的作用则一直随暴露时间延长而增高,于24h／0h达最高值。此外COL和VBL可诱发V79细胞有丝分裂阻滞,而MMC和BLM无此作用；与之对应的是前二者对细胞存活／生长具有一定抑制作用,而后二者没有明显影响。以上结果对后续利用表达生物转化酶细胞微核试验染毒过程的探索提供了适当参考。2.与COL和VBL对V79细胞的作用类似,1-甲基芘(1-MP)和1-羟甲基芘(1-HMP)对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞诱发微核的作用在暴露／恢复时程为18h／6h时达到峰值；苯的羟化代谢物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞的作用则与断裂剂对V79细胞的作用相似：儿茶酚(CAT)和1,2,4-三羟基苯(THB)在6h／18h时诱发微核作用最强,氢醌(HQ)作用的峰值出现在暴露时间稍长的时程。此外,1-MP和1-HMP对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞呈现一定细胞毒作用,且随暴露时间延长而增强；相反,HQ、CAT和THB则没有明显的细胞毒作用。并且,1-HMP和1-MP诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞明显的有丝分裂阻滞,而CAT、THB和HQ则无明显作用。在各暴露／恢复时程条件下,各受试物的高剂量组诱发微核和有丝分裂阻滞的作用均强于低剂量组。3.蛋白印迹试验结果显示,V79-mCYP2E1相比于V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞中CYP2E1蛋白表达水平略低。五个受试化合物对V79细胞均未诱发基因突变；然而,NDMA对V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞和V79-mCYP2E1细胞均强烈诱发基因突变,且呈明显的浓度-效应关系,PCB 5和PCB 18可明显诱发V79-hCYP2E1-hSULT1A1细胞基因突变,但对V79-mCYP2E1细胞仅有微弱的致突变作用。PCB 20和PCB 28对后两种受试细胞仅有微弱的致突变作用。结论1.与既往报道相似,不同暴露／恢复时程下,断裂剂和致非整倍体剂诱发V79细胞微核的作用有明显差异,分别于不同时程(12h／12h和24h／0h)达到其作用的峰值。结果提示在采用细胞系的体外微核试验中,短暴露／长恢复时程可能有利于检测断裂剂的作用,而长暴露／短(或零)恢复则更易检出致非整倍体剂。2.根据以上断裂剂和致非整倍体剂诱发培养细胞微核作用与暴露/恢复时程的关系,结合不同受试物对V79-hCYP2E1-hSULT1A1诱发微核及有丝分裂阻滞作用的差异,可认为两个烷基化芘化合物(1-HMP和1-MP)经CYP2E1酶和／或SULT1A1酶代谢活化成为具有微管毒性及致非整倍体毒性的代谢物；而苯的羟化代谢物中,CAT和THB具有断裂作用,HQ则可能兼有断裂作用与致非整倍体作用。代谢活化虽有时间依赖性,但上述间接致突变物诱发微核作用的时程与直接致突变物相比并不延迟,所以细胞系微核试验的标准程序至少对本研究采用的细胞内代谢活化模型是适用的。3.受试化合物对表达不同种属CYP2E1的V79重组细胞致突变作用在强度和效能上的差异,特别明显表现在PCB 18和PCB 5对上述两种受试细胞致突变作用的巨大差异,这不能完全由相关生物转化酶表达水平的差异较小来解释,而主要与酶蛋白的种属差异性有关。因此,小鼠作为分析PCBs遗传毒作用的体内试验模型可能并不符合特异性代谢活化的条件,而对于其他常用的体内试验动物模型(大鼠、兔)是否适用仍需进一步探讨。