第一部分PTPRO/TLR4/NF-κB在肝癌中的作用背景:炎症常伴随或促进肿瘤发生,并在肿瘤生长、浸润、转移、逃逸及消退中发挥重要作用。炎症反应本身是宿主防御的重要机制,参与清除外来病原体、修复组织损伤、参与组织再生等过程。若给予适当干预,急性炎症并不会干扰机体内环境平衡,反而能参与组织修复及重塑。然而,病原体长期慢性感染能够逃避免疫监视、打破免疫耐受,最终导致肿瘤发生。原发性肝癌是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一,近年来,其发病率与死亡率均上升,致死率列全球高致死性肿瘤第三位,被称为“癌中之王”。原发性肝癌通常发生在慢性肝损伤的基础上,包括慢性肝炎、肝硬化,二者被认为是肝脏癌前病变。长期慢性肝脏炎性状态促使肝硬化发生,并激活肝脏细胞的再生潜能,即肝脏自我修复。肝脏自我修复的短暂激活能够迅速修复受损的肝组织,但若持续激活则可维持长期的炎症反应,进而诱发肿瘤。临床上,肝癌可分为肝细胞型、胆管细胞型、混合型三种,其中以肝细胞性肝癌(HCC)最为常见。HCC的主要病因为慢性活动性肝炎,包括HBV和HCV导致的病毒性肝炎,酒精性肝炎及非酒精性脂肪肝。目前国内常见的HCC以HBV感染为主要途径。研究发现,Toll样受体4(TLR4)介导的固有免疫信号网络在肝癌的发生、进展中扮演重要角色,但它是促癌还是抑癌因素仍然存在争议。受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPRO)是一种新型肿瘤抑制因子,它在肝癌组织中明显下调,但对LPS/TLR4介导的肝损伤的调控作用,至今尚无报道。目的:探讨PTPRO对LPS/TLR4信号活化的影响及它们在肝癌中的调节作用。方法:(1)Real-time PCR及Westernblot法分别检测84例HCC病人癌与癌旁组织中PTPRO与TLR4m RNA及蛋白水平的表达;(2)构建PTPRO过表达慢病毒载体,并稳转肝癌细胞株Hu H7及SNU423;(3)检测PTPRO过表达Hu H7及SNU423细胞TLR4 m RNA及蛋白水平的表达;(4)检测LPS刺激的肝癌细胞PTPRO与TLR4 m RNA及蛋白水平的表达;同时Westernblot及激光共聚焦观察LPS刺激对IκBα、NF-κB/P65的活化情况;(5)CCK-8法检测LPS刺激对PTPRO过表达的Hu H7细胞增殖的情况;(6)观察Bay11-7082对LPS刺激的Hu H7细胞PTPRO m RNA及蛋白水平的影响;(7)荧光素酶报告基因检测技术观察LPS刺激对Hu H7细胞PTPRO启动子活性的改变。结果:(1)PTPRO与TLR4在HCC病人癌组织中明显低表达,Pearson相关分析提示二者呈明显正相关关系;(2)Hu H7及SNU423肝癌细胞株成功稳定过表达PTPRO;(3)PTPRO过表达的Hu H7及SNU423细胞TLR4也被明显上调;(4)LPS能够通过活化IκBα、NF-κB/P65上调PTPRO的表达,但TLR4表达没有明显变化;(5)PTPRO过表达Hu H7细胞生长被抑制;(6)Bay11-7082能够抑制LPS对Hu H7细胞PTPRO的上调作用;(7)PTPRO启动子突变后失去NF-κB/Rel同源结构域的结合序列,因而,LPS不能刺激其活化。结论:PTPRO与LPS/TLR4在HCC相关性炎症中存在反馈调控,这一反馈调节作用通过NF-κB信号通路的活化来实现。第二部分PTPRO/TLR4/NF-κB在暴发性肝炎中的作用背景:暴发性肝炎又称急性坏死性肝炎、急性肝衰竭、暴发性肝衰竭,以肝细胞大量坏死而出现的以肝功能严重受损为特征,致死率很高,主要诱因有感染,过度饮酒,过量使用药物等。肝脏缺血-再灌注损伤的肝细胞的PTPRO能够减轻肝损伤,而在巨噬细胞中,PTPRO则加重肝损伤,这一相反作用是通过反馈调控NF-κB的活性实现的,提示PTPRO在不同的免疫微环境中可能具有不同的调控作用。TLR4是TLRs家族的重要分子,它是LPS的膜受体,属于TLR家族,是一种跨膜蛋白。研究提示,TLR4及其下游信号的活化能够促进暴发性肝炎的发生及病程进展。本课题组前期研究发现PTPRO与TLR4/NF-κB信号形成反馈调控回路,对HCC相关性炎症具有调节作用。PTPRO及PTPRO与TLR4/NF-κB信号的相互作用对暴发性肝炎发病的影响目前少见报道。本章节应用LPS/D-Ga IN腹腔注射模拟巨噬细胞介导的小鼠暴发型肝炎模型,通过观察PTPRO对LPS介导的肝脏炎症反应的调节作用,探讨PTPRO与TLR4/NF-κB在FH中的调控机制。目的:探讨PTPRO/LPS/TLR4在暴发性肝炎中的作用。方法:(1)LPS/D-Ga IN给药后,观察PTPRO WT及KO小鼠的生存率;(2)LPS/D-Ga IN给药后,观察小鼠肝脏损伤情况,包括肝酶生化检测、HE染色及TUNEL凋亡检测;(3)Real-time PCR及ELISA法分别检测小鼠血清及肝内炎性因子的表达;(4)FACS检测小鼠脾脏内F4/80+TLR4+细胞的浸润情况;Real-time PCR及Western-blot法检测小鼠肝组织TLR4的表达;(5)FACS观察小鼠脾脏T淋巴细胞的亚型;(6)LPS/D-Ga IN腹腔注射后,Western-blot检测小鼠脾脏淋巴细胞IκB-α、NF-κB/P65的磷酸化水平;免疫组化观察p-NF-κB/P65的核转位;(7)体外刺激培养RAW264.7,观察PTPRO对LPS/TLR4介导的巨噬细胞炎症反应的调节作用。结果:(1)LPS/D-Ga IN腹腔注射后,PTPRO KO小鼠较WT小鼠死亡率升高,给药48h后,两组小鼠均死亡;(2)LPS/D-Ga IN给药后,PTPRO KO小鼠肝酶升高,肝组织较野生小鼠坏死更加明显、肝细胞大量凋亡;(3)PTPRO KO小鼠肝内及血清中TNF-α、IL-6 m RNA水平较空白对照组升高,但低于PTPRO WT小鼠;(4)LPS/D-Ga IN给药后,PTPRO KO小鼠脾脏内浸润的F4/80+TLR4+细胞明显低于WT小鼠,PTPRO KO小鼠肝组织中TLR4的表达较空白对照组升高,但明显低于WT小鼠;(5)PTPRO KO小鼠脾脏内CD3+IFN-γ+、CD3+TNF-α+细胞均较WT小鼠明显减少;(6)PTPRO KO小鼠脾脏淋巴细胞p-IκB-α及p-NF-κB/P65较WT小鼠明显下调;PTPRO KO小鼠肝组织中p-NF-κB/P65核转位低于WT小鼠,Bay11-7082则能抑制LPS/D-Ga IN对小鼠脾脏淋巴细胞的活化;(7)PTPRO能够调控LPS/TLR4介导的急性炎症反应,PTPRO与TLR4的反馈调控依赖NF-κB信号途径。结论:PTPRO在LPS/TLR4介导的肝脏损伤中调节机制复杂,在肝细胞本身及其炎症微环境中浸润的炎性细胞中的作用可能是相反的;PTPRO与TLR4可能通过NF-κB信号实现反馈调控,是联系固有免疫与肝脏免疫的桥梁,但二者的反馈调控机制有待于深入研究。