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铂类药物顺铂是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗的一线药物，能引起DNA双链断裂（DNA double-strand breaks,DSB），而肿瘤细胞双链DNA损伤的修复能力增强，与其先天性或获得性耐药密切相关。虽然驱动蛋白家族成员4A（kinesin family member4A,KIF4A）已被报道能调节多种DSB修复相关蛋白如乳腺癌蛋白2（breast cancer2,BRCA2）和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1）的功能，但KIF4A与人NSCLC细胞顺铂化疗敏感性之间的关系仍不清楚，并且，靶向KIF4A对细胞中DSB修复相关蛋白功能的影响，人们尚知之甚少。为此进行以下研究。
一、目的：
通过靶向KIF4A分子表达，研究KIF4A蛋白表达变化对人NSCLC细胞顺铂化疗敏感性的影响，探讨KIF4A通过调节DNA损伤修复功能影响NSCLC细胞化疗敏感性的机制，为NSCLC化疗耐药治疗提供新思路。
二、方法：
1、为研究顺铂处理NSCLC细胞后KIF4A蛋白的表达变化，用10μmol/L顺铂处理或不处理H1299细胞12h、24h、48h和72h后，用Western blot方法检测细胞中KIF4A蛋白的表达变化。
2、为研究敲低KIF4A对NSCLC细胞顺铂敏感性的影响，以慢病毒空载体（shRNA-NC）为对照，用靶向人KIF4A基因的多个慢病毒载体shRNA-KIF4A感染H1299细胞，经嘌呤霉素药物筛选后，构建稳定敲低KIF4A的H1299细胞株shRNA-KIF4A-(3)和shRNA-KIF4A-(4)。用不同浓度顺铂处理稳定敲低KIF4A的H1299肺癌细胞，通过克隆形成实验和细胞凋亡实验（膜联蛋白（Annexin）V和碘化丙啶（Propidium,PI）双重染色法），观察敲低KIF4A对NSCLC细胞顺铂敏感性的影响。
3、鉴于顺铂诱导的DNA损伤能够导致细胞S和G2期细胞周期阻滞，而细胞周期在DSB的修复方式选择中具有重要作用，用不同浓度顺铂处理稳定敲低KIF4A的H1299细胞及shRNA-NC空载体对照组H1299细胞后，采用PI染色法检测细胞周期变化，观察敲低KIF4A对顺铂诱导的细胞周期阻滞的影响。
4、为探讨抑制KIF4A增强顺铂诱导的H1299细胞DNA损伤的可能机制，shRNA-NC空载体对照组H1299细胞与稳定敲低KIF4A的H1299细胞，经顺铂处理后，用免疫荧光法检测细胞核内BRCA2和RAD51的焦点（focus）形成，用Western blot方法检测细胞中DSB修复相关蛋白BRCA2、RAD51和PARP-1蛋白表达及活性变化。
三、结果：
1、顺铂处理促进人NSCLC细胞H1299中KIF4A蛋白表达。
H1299细胞中存在KIF4A蛋白表达，并且，经10μmol/L顺铂处理12小时、24小时、48小时和72小时后，细胞中KIF4A蛋白表达分别增加69%、168%、130%和150%。以上结果表明，用顺铂处理H1299细胞增加KIF4A蛋白的表达。
2、敲低KIF4A增加人NSCLC细胞H1299对顺铂的敏感性。
用1μmol/L和2μmol/L顺铂处理后，H1299对照组细胞（shRNA-NC）分别有54个和26个克隆形成，而shRNA-KIF4A-(3)和shRNA-KIF4A-(4)稳定敲低KIF4A的细胞株使用1μmol/L顺铂处理细胞后，分别有16个和43个细胞克隆形成；使用2μmol/L顺铂处理细胞后，分别只有11个和18个细胞克隆形成。以上结果表明，敲低KIF4A细胞组的克隆形成能力出现显著下降，提示敲低KIF4A基因可以增强顺铂对H1299细胞的药物毒性作用。
在细胞凋亡方面，经10μmol/L顺铂处理后，对照组shRNA-NC H1299细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别是7.8%和11.4%，但是，敲低KIF4A基因组细胞的凋亡率显著增加，其中shRNA-KIF4A-(3)稳定感染H1299细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别是20.0%和20.1%；shRNA-KIF4A-(4)稳定感染H1299细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别是15.6%和17.8%。以上结果表明，抑制KIF4A基因可以显著增加顺铂诱导的H1299细胞早期和晚期凋亡，使细胞对顺铂的敏感性增加。
3、敲低KIF4A增加顺铂诱导的人H1299肺癌细胞周期阻滞。
对于shRNA-NC对照H1299细胞，较高浓度（10μmol/L）顺铂可以导致细胞既产生S期又产生G2/M期细胞周期阻滞，而顺铂浓度下降为5μmol/L浓度时，G2/M期细胞周期阻滞持续存在，但是S期阻滞显著减少。值得注意的是，敲低KIF4A既显著增加较低浓度（5μmol/L）顺铂诱导的细胞周期G2/M期阻滞，又显著增加较高浓度（10μmol/L）顺铂诱导的细胞周期S期阻滞。以上结果表明，抑制KIF4A增加顺铂产生的细胞周期S期和G2/M期阻滞。
4、敲低KIF4A抑制人NSCLC细胞H1299的DNA损伤修复能力。
用10μmol/L顺铂处理后，对照组shRNA-NC H1299细胞核内出现大约70%BRCA2和60%RAD51的焦点形成。然而，敲低KIF4A后，顺铂诱导的H1299细胞核内BRCA2和RAD51的焦点形成显著减少，两者均仅有大约40%，表明敲低KIF4A可以抑制顺铂诱导人NSCLC细胞核中BRCA2和RAD51焦点形成能力。
在BRCA2和RAD51蛋白表达方面，用10μmol/L顺铂处理shRNA-NC对照H1299细胞不同时间（0、12h、24h、48h和72h）后，其BRCA2和RAD51蛋白表达明显增加，两者均在用药后24h达到最高峰。然而，虽然单独敲低KIF4A并未显著影响H1299细胞内BRCA2和RAD51蛋白表达，但是，敲低KIF4A后，顺铂诱导的BRCA2和RAD51蛋白表达增加均受到限制，其中，BRCA2蛋白在用药后12小时和24小时，而RAD51蛋白仅在用药后24小时受到显著限制。
在PARP-1蛋白表达和活性变化方面，当用10μmol/L顺铂处理shRNA-NC对照H1299细胞时，其PAPR-1活性随着处理时间延长显著增加，呈现时间依赖性。与shRNA-NC对照细胞不同，虽然单独敲低KIF4A确实能增加H1299细胞内PARP-1活性，但是，敲低KIF4A也显著减少PARP-1蛋白表达，导致顺铂无法随处理时间延长进一步增加细胞内PARP-1活性。这些结果表明，敲低KIF4A限制顺铂诱导的人H1299肺癌细胞内PARP-1活性进一步增加。
四、结论：
顺铂促进人H1299肺癌细胞内KIF4A蛋白表达；而敲低KIF4A抑制顺铂诱导的人H1299肺癌细胞核内BRCA2和RAD51的焦点形成，和限制顺铂诱导的PARP-1活性进一步增加，从而增强顺铂诱导的肺癌细胞周期阻滞和细胞毒性，提示驱动蛋白KIF4A是一种新的肿瘤化疗敏感性的调节因子，抑制KIF4A能通过多种机制显著增强人NSCLC细胞的顺铂敏感性。
一、目的：
通过靶向KIF4A分子表达，研究KIF4A蛋白表达变化对人NSCLC细胞顺铂化疗敏感性的影响，探讨KIF4A通过调节DNA损伤修复功能影响NSCLC细胞化疗敏感性的机制，为NSCLC化疗耐药治疗提供新思路。
二、方法：
1、为研究顺铂处理NSCLC细胞后KIF4A蛋白的表达变化，用10μmol/L顺铂处理或不处理H1299细胞12h、24h、48h和72h后，用Western blot方法检测细胞中KIF4A蛋白的表达变化。
2、为研究敲低KIF4A对NSCLC细胞顺铂敏感性的影响，以慢病毒空载体（shRNA-NC）为对照，用靶向人KIF4A基因的多个慢病毒载体shRNA-KIF4A感染H1299细胞，经嘌呤霉素药物筛选后，构建稳定敲低KIF4A的H1299细胞株shRNA-KIF4A-(3)和shRNA-KIF4A-(4)。用不同浓度顺铂处理稳定敲低KIF4A的H1299肺癌细胞，通过克隆形成实验和细胞凋亡实验（膜联蛋白（Annexin）V和碘化丙啶（Propidium,PI）双重染色法），观察敲低KIF4A对NSCLC细胞顺铂敏感性的影响。
3、鉴于顺铂诱导的DNA损伤能够导致细胞S和G2期细胞周期阻滞，而细胞周期在DSB的修复方式选择中具有重要作用，用不同浓度顺铂处理稳定敲低KIF4A的H1299细胞及shRNA-NC空载体对照组H1299细胞后，采用PI染色法检测细胞周期变化，观察敲低KIF4A对顺铂诱导的细胞周期阻滞的影响。
4、为探讨抑制KIF4A增强顺铂诱导的H1299细胞DNA损伤的可能机制，shRNA-NC空载体对照组H1299细胞与稳定敲低KIF4A的H1299细胞，经顺铂处理后，用免疫荧光法检测细胞核内BRCA2和RAD51的焦点（focus）形成，用Western blot方法检测细胞中DSB修复相关蛋白BRCA2、RAD51和PARP-1蛋白表达及活性变化。
三、结果：
1、顺铂处理促进人NSCLC细胞H1299中KIF4A蛋白表达。
H1299细胞中存在KIF4A蛋白表达，并且，经10μmol/L顺铂处理12小时、24小时、48小时和72小时后，细胞中KIF4A蛋白表达分别增加69%、168%、130%和150%。以上结果表明，用顺铂处理H1299细胞增加KIF4A蛋白的表达。
2、敲低KIF4A增加人NSCLC细胞H1299对顺铂的敏感性。
用1μmol/L和2μmol/L顺铂处理后，H1299对照组细胞（shRNA-NC）分别有54个和26个克隆形成，而shRNA-KIF4A-(3)和shRNA-KIF4A-(4)稳定敲低KIF4A的细胞株使用1μmol/L顺铂处理细胞后，分别有16个和43个细胞克隆形成；使用2μmol/L顺铂处理细胞后，分别只有11个和18个细胞克隆形成。以上结果表明，敲低KIF4A细胞组的克隆形成能力出现显著下降，提示敲低KIF4A基因可以增强顺铂对H1299细胞的药物毒性作用。
在细胞凋亡方面，经10μmol/L顺铂处理后，对照组shRNA-NC H1299细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别是7.8%和11.4%，但是，敲低KIF4A基因组细胞的凋亡率显著增加，其中shRNA-KIF4A-(3)稳定感染H1299细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别是20.0%和20.1%；shRNA-KIF4A-(4)稳定感染H1299细胞早期凋亡率和晚期凋亡率分别是15.6%和17.8%。以上结果表明，抑制KIF4A基因可以显著增加顺铂诱导的H1299细胞早期和晚期凋亡，使细胞对顺铂的敏感性增加。
3、敲低KIF4A增加顺铂诱导的人H1299肺癌细胞周期阻滞。
对于shRNA-NC对照H1299细胞，较高浓度（10μmol/L）顺铂可以导致细胞既产生S期又产生G2/M期细胞周期阻滞，而顺铂浓度下降为5μmol/L浓度时，G2/M期细胞周期阻滞持续存在，但是S期阻滞显著减少。值得注意的是，敲低KIF4A既显著增加较低浓度（5μmol/L）顺铂诱导的细胞周期G2/M期阻滞，又显著增加较高浓度（10μmol/L）顺铂诱导的细胞周期S期阻滞。以上结果表明，抑制KIF4A增加顺铂产生的细胞周期S期和G2/M期阻滞。
4、敲低KIF4A抑制人NSCLC细胞H1299的DNA损伤修复能力。
用10μmol/L顺铂处理后，对照组shRNA-NC H1299细胞核内出现大约70%BRCA2和60%RAD51的焦点形成。然而，敲低KIF4A后，顺铂诱导的H1299细胞核内BRCA2和RAD51的焦点形成显著减少，两者均仅有大约40%，表明敲低KIF4A可以抑制顺铂诱导人NSCLC细胞核中BRCA2和RAD51焦点形成能力。
在BRCA2和RAD51蛋白表达方面，用10μmol/L顺铂处理shRNA-NC对照H1299细胞不同时间（0、12h、24h、48h和72h）后，其BRCA2和RAD51蛋白表达明显增加，两者均在用药后24h达到最高峰。然而，虽然单独敲低KIF4A并未显著影响H1299细胞内BRCA2和RAD51蛋白表达，但是，敲低KIF4A后，顺铂诱导的BRCA2和RAD51蛋白表达增加均受到限制，其中，BRCA2蛋白在用药后12小时和24小时，而RAD51蛋白仅在用药后24小时受到显著限制。
在PARP-1蛋白表达和活性变化方面，当用10μmol/L顺铂处理shRNA-NC对照H1299细胞时，其PAPR-1活性随着处理时间延长显著增加，呈现时间依赖性。与shRNA-NC对照细胞不同，虽然单独敲低KIF4A确实能增加H1299细胞内PARP-1活性，但是，敲低KIF4A也显著减少PARP-1蛋白表达，导致顺铂无法随处理时间延长进一步增加细胞内PARP-1活性。这些结果表明，敲低KIF4A限制顺铂诱导的人H1299肺癌细胞内PARP-1活性进一步增加。
四、结论：
顺铂促进人H1299肺癌细胞内KIF4A蛋白表达；而敲低KIF4A抑制顺铂诱导的人H1299肺癌细胞核内BRCA2和RAD51的焦点形成，和限制顺铂诱导的PARP-1活性进一步增加，从而增强顺铂诱导的肺癌细胞周期阻滞和细胞毒性，提示驱动蛋白KIF4A是一种新的肿瘤化疗敏感性的调节因子，抑制KIF4A能通过多种机制显著增强人NSCLC细胞的顺铂敏感性。