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临床上非创伤性股骨头缺血性坏死(Avascular necrosis of the femoral head，ANFH)多见，致残率高。其中，酒精引发的ANFH已占第一位，酒精能够诱导骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，并引起脂质代谢异常，继而发生骨组织变性坏死。但目前尚未见到有关此机制防治研究的报道。我们在分离获取小鼠原代骨髓基质细胞(Marrow stromal cells，MSCs)的基础上，加入酒精及葛根素进行体外培养，采用细胞学和分子生物学的检测方法，观察葛根素对酒精诱导MSCs成脂分化的抑制作用，从新的角度深入探讨酒精性ANFH的药物保护机制。 材料和方法 河南省实验动物中心提供6～8周龄雌性昆明小白鼠，取小白鼠双侧股骨骨髓细胞，通过贴壁培养分离、获取MSCs。接种细胞时即在模型组加入0．09mol／L酒精，在实验组加入0.09mol／L酒精和0.01mg／ml葛根素，对照组不加酒精与葛根素，均培养21天。苏丹Ⅲ染色，作脂肪细胞计数；用甘油三酯及碱性磷酸酶(ALP)试剂盒分别在生化分析仪上测定21天的MSCs内甘 — —＿．．＿郑州大学2002届研究生毕业论文 葛根素抑制酒精诱导骨髓基质细胞成脂分化的实验研究油三酯含量及 12大的 MSCS内 ALP活性；用放射免疫分析法测定14天培养液中的骨钙素含量；采用考马斯亮蓝方法，测定MSCs内蛋白质；采用逆转录聚合酶链式反应（RTICR）技术，检狈细胞中成脂转录回于（adipogenic transcription factor）P啊mRNA和成骨基因Osteocalcin（骨钙素）InRNA的表达。 结果 l．根据MSCS贴壁生长特性，可将MSCs与骨髓内其它细胞分离开。 2．模型组、实验组、对照组持续作用刀大时，三组出现脂肪细胞的数量依次是：319＊ 士1992；35．92士23．77；20．42土12二5个儿m气对照组中脂肪细胞数量最少，模型组脂肪细胞数明显增多，与其它两组差异均有高度显著性p功刀01人加入葛根索的实验组脂肪细胞数明显减少，且与对照组差异无显著性 0＞0刀5）。 3．细胞培养刀大后，模型组中细胞内甘油三酯含量是实验组的 2．8倍，是对照组的 3．4倍，差异均有高度显著性0叩刀of人实验组明显低于模型组且和对照组间差异无显著性J＞0刀5人 4，MSCS培养14大，实验组培养液中的骨钙素含量约是模型组的2．2倍，模型组与其他两组之间差异均有高度显著性 p叱．00人 而实验组与对照组间差异无显著性o功．05人 5．细胞培养 12天，实验组的 ALP活性是模型组的 2倍，且实验组和对照组间的差异无显著性0列刀5人 而模型组与另外两组间差异均有高度显著性o叼刀of人 6．基因表达：用酒精或酒精加葛根素处理细胞6大后，通过凝胶成像扫描系统做PCR产物半定量分祈，显示模型组细胞中 OSteocalcin IlmNA的表达降低，而实验组和对照组细胞中 2郑州大学2002届研究生毕业论文 葛根素抑制酒精诱导骨髓基质细胞成脂分化的实验研究Osteocalcin mRNA表达增加，分别是模型组的 1．9倍和 2．4倍，两组与模型组之间的差异均有高度显著性J叱刀1人 且实验组与对照组间差异无显著性（P＞0．05人模型组细胞中PP川幻InRNA表达增加，而实验组和对照组细胞中 PPARY nltNA表达降低，两组与模型组之间的差异均有显著性（P＜0刀5人 而对照组与实验组间差异无显著性0叩．05人 结论 葛根素能够对抗酒精的毒性作用，使MSCS分化过程趋于正常： 1．葛根素能够抑制酒精诱导MSCS分化为脂肪细胞； 2．降低MSCS内甘油三酯含量； 3．降低 MSCS中成脂转录因子 PPAR IlinNA的表达，抑制酒精诱导＊SCs的成脂分化： 4．升高M S＊s内AL P活性： 5．升高MSCS培养液中骨钙素含量； 6．增加 MSCs中成骨基因＊steocalcin mRNA的表达，保持MSCS的成骨分化特性。 本实验结果表明，葛根素可以抑制酒精诱导骨髓基质细胞分化成脂肪细胞，维持其主要分化为成骨细胞，减少骨内脂肪堆积，可能预防骨坏死。