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鸡肺表面活性蛋白A(chicken pulmonary surfactant protein A,cSP-A)是鸡肺房上皮细胞分泌的一种亲水性糖蛋白,其基因序列与哺乳动物SP-A有一定的同源性,在机体呼吸系统先天性免疫防御中发挥重要作用,是家禽呼吸系统中最为重要的天然免疫蛋白之一。本研究的主要目标是通过原核系统表达可溶性cSP-A蛋白,制备其单抗;通过建立病毒感染模型,研究cSP-A的组织病理学变化,为cSP-A抗病毒的机制研究和临床应用奠定基础,主要包括以下几方面内容。1.cSP-A可溶性表达及检测将cSP-A全长基因序列插入pCold-TF载体中,构建重组载体pCold-cSP-A,转化到感受态宿主菌BL21(DE3)中,加入不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于16°C中诱导表达24h,经超声波裂解,通过His-bind纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE检测。结果cSP-A蛋白获得可溶性表达,融合蛋白大小为80 KDa。Western Blot结果显示,该蛋白可被特异性多抗识别。抑菌实验显示,与纯化的天然cSP-A蛋白不同,cSP-A原核表达产物并不具备抑菌活性。2.cSP-A单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定利用pCold-cSP-A纯化蛋白作为免疫原,等体积包裹弗氏佐剂,腹腔注射6周龄的BALB/c小鼠,制备抗cSP-A单克隆抗体。用pcDNA3.1-cSP-A真核表达载体转染293T细胞经间接IFA筛选单抗,获得3株单克隆抗体,分别命名为:1D12、2F1和5C8;对3株抗体进行亚型鉴定,3株单抗轻链均为κ,1D12重链为IgG1,2F1和5C8均为IgG2a;经IFA、间接ELISA及Western Blot检测发现:1D12株单抗效价最高,特异性最好。对1D12和5C8株单抗进行抗原表位的鉴定,结果发现两株单抗均针对cSP-A蛋白的45-60aa,属于该蛋白的亲水区。3.cSP-A荧光定量RT-PCR方法的建立及检测设计153bp的cSP-A的qRT-PCR引物,选择cβ-actin(JN639846)为内参基因,以pcDNA3.1-cSP-A重组质粒作为阳性标准品,建立cSP-A的SYBR Green I RT-PCR检测方法,对30日龄SPF鸡的肺、气管、支气管、喉头、气囊、肝、脾、肾、胰、十二指肠、盲肠和法氏囊等组织样品进行qRT-PCR的检测。以法氏囊的Ct值为对照,用2(-ΔΔCt)相对定量PCR法计算分析cSP-A基因在SPF鸡各组织中的相对表达量,用GraphPad Prism 5软件进行统计。结果成功建立了qRT-PCR方法,标准曲线的线性回归方程为Y=-3.5832X+36.07(R2=0.99303),敏感度检测可达1.58×102拷贝/μL。结果发现:在30日龄SPF鸡的各组织中,cSP-A的表达量依次为:肺、气管、支气管、喉头、气囊、肾脏。此外,肝、脾、胰中有非常少量的表达。4.H9N2流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒感染SPF鸡对cSP-A表达量的影响设置IBV组、NDV组、H9N2组、IBV和H9N2共感染组、对照组共5组,每组8只4周龄SPF鸡,滴鼻攻毒,对照组为无菌PBS。攻毒后第3天,每组取3只鸡进行肺、气管、支气管、前喉、气囊、肝、脾、肾、胰、十二指肠、盲肠和法氏囊脏器的采集。所有脏器取两份,一份液氮冻存,一份10%福尔马林浸泡。分别用H&E染色,qRT-PCR检测以及免疫组化方法(IHC)检测样本的病理变化以及cSP-A表达量的变化。H&E染色结果显示,对照组鸡各脏器没有明显的病理变化,而各攻毒组鸡各脏器均有不同程度的病变,其中以NDV组最为严重,混合感染组比H9N2单独攻毒组、IBV单独攻毒组病理变化更加明显。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,各攻毒组呼吸道中cSP-A表达量均明显下降,且H9N2+IBV共感染组中表达量比单独攻毒组更低。这一结果在免疫组化中再次得到验证。这说明cSP-A也许可作为呼吸道病理损伤的检测指标之一。通过以上实验,本研究成功地在大肠杆菌中表达了cSP-A可溶性蛋白,并制备了较高效价的单克隆抗体,并利用此单抗检测了cSP-A的病理组织学变化,为下一步深入研究c SP-A的抗病毒机制及临床作用研究奠定了基础。