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由致病真菌Botryosphaeria dothidea所引起的苹果轮纹病严重影响苹果果实的产量和品质,造成巨大的经济损失,严重制约苹果产业的发展。目前对于该病的防治尚无十分行之有效的方法。研究苹果轮纹病的免疫信号途径,发掘调控苹果轮纹病抗性基因,培育苹果抗病新品种,对于改善苹果轮纹病造成的损失具有重要的意义。苹果在遭受轮纹病菌侵染时,由病原菌相关分子模式(PAMPs)激发的免疫反应途径(PTI)随即被激活。植物与病原菌互作过程中通常会激发激素水平的变化,研究苹果与轮纹病菌互作的机制丰富了苹果本身的免疫调控网络。而目前对苹果与轮纹病菌互作的机制研究较少。轮纹病菌在侵染苹果果实的同时,伴随着乙烯的大量合成。而乙烯在两者互作过程中的作用及具体的调控机制尚未可知。本研究以’富士’未成熟果实和苹果愈伤细胞为试材,接种轮纹病菌的同时施加外源乙烯,运用遗传学和生化方法研究乙烯在病菌侵染过程中所起的作用及其调控机制。首先明确了乙烯对二者互作过程的影响:乙烯作为致病因子特异性增强了苹果对轮纹病菌的感病性。其次通过植物中广泛存在的MAPK级联途径分析了乙烯负调控苹果MAPK-WRKY33免疫信号途径的分子机制。具体研究结果如下:1、乙烯负调控苹果对于轮纹病菌的抗性,且这种调控是特异的,因病菌的差异而不同。乙烯作为苹果的抗病因子,减弱了对灰霉病和苹果腐烂病的病斑扩展,而与二者相反的是,对于轮纹病菌,乙烯则加快了病菌的侵染,且在苹果果实和愈伤中的表型相同,表明这种作用无组织差异性,因此苹果与轮纹病菌的互作是特异的。2、目前对于苹果轮纹病与MAPK级联途径的研究尚未见报道。本研究结果表明轮纹病菌侵染过程中,乙烯特异的抑制了 MAPK活性,而对于腐烂病菌则正好相反,乙烯增强了其MAPK活性。3、MAPK的活性改变,其下游靶标基因的表达水平也随之改变。随着乙烯处理浓度的增强,MdWRKY33-1/2/3、MdPR4/5/8/以及MdChiB-1的表达呈梯度下降趋势,而MdWRKY40、MdERF3/6、MdChiB-2以及MdPG1等的表达则与乙烯的剂量不成比例。说明乙烯特异性降低了MdWRKY33-1/2/3、MdPR4/5//以及MdChiB-1的转录水平。4、本研究中Western blot结果显示乙烯主要影响了 MPK3/6的活性。将苹果中MdMPK3/6构建稳定表达载体,分别转化苹果愈伤后得到超表达的转基因愈伤,接种轮纹病菌后发现,与野生型对比,超表达MdMPK3/6显著提高了MdPR4/5/8、MdWRKY33-1的表达水平。对接菌的愈伤进行乙烯处理,发现外源乙烯抑制了 MdMPK3的活性,且同时抑制了 MPK3对MdWRKY33-1的磷酸化水平,而对于MdMPK6,因其超表达后蛋白表达的本底水平过高,乙烯的作用微乎其微。虽然未能发现乙烯对MdMPK6活性的影响,但Pull down试验的结果证实在轮纹病菌侵染过程中乙烯阻止了 MdMPK6与MdWRKY33-1的互作。为了验证乙烯对苹果轮纹病的特异性,我们对转基因愈伤接种了苹果腐烂病菌,并同时施加外源乙烯后发现,乙烯增强了 MdMPK3的活性及其对MdWRKY33-1的磷酸化。5、本研究中乙烯特异性抑制了苹果轮纹病菌诱导的MdWRKY33-1的表达,将其在苹果愈伤细胞中超表达后发现MdChiB-1和MdACS5A也随之上调表达,而MdPR4/5/8则没有明显的变化,预示着MdWRKY33与MdChiB-1和MdACS5A之间可能存在上下调控关系。EMSA试验结果表明MdWRKY33-1均能与MdChiB-1和MdACS5A启动子中的W-box特异性结合,且结合域均位于MdWRKY33-1蛋白中第一个WRKY结构域。除W-box外,MdChiB-1启动子的W-box附近存在一段序列:AAACT,是MdWRKY33-1与MdChiB-1启动子的另一个结合位点。MdWRKY33-1与这2个位点形成的DNA-蛋白复合物分子量大小不同,暗示其可能通过形成同源或异源二聚体来调控MdChiB-1的表达。ChIP试验的结果表明乙烯抑制了 MdWRKY33-1与MdChiB-1启动子的结合。将MdChiB-1的启动子序列构建到含有荧光素酶基因的瞬时表达载体中,与带有HA标签的MdWRKY33-1共转苹果愈伤的原生质体,检测荧光素酶活性。结果表明MdChiB-1 pro-LUC与MdWRKY33-1-2HA共转后荧光素酶活性有微弱提高,约为对照(MER)的2.73倍,但与AtMKK7-2HA共表达后则增强了荧光素酶的活性,达到对照(MER)的10.5倍,而AtMKK5则效果不明显。Western结果显示AtMKK7超表达后明显激活了苹果细胞MAPK的活性,而AtMKK5则没有。暗示MdChiB-1的转录活性可能需要MAPK的激活。6、前人研究表明病菌侵染过程中乙烯的释放是由MdACS5A、MdACS5B的诱导表达来实现的。在苹果愈伤中超表达MdWRKY33-1,抑制腐烂病菌的侵染,但对轮纹病的效果却不如腐烂病显著。MdWRKY33-1既能调控MdChiB-1,又能与MdACS5A的启动子结合,而乙烯促进苹果轮纹病的侵染,因此推测MdWRKY33-1超表达对轮纹病效果不显著的原因可能与MdACS5A有关。7、更为有趣的是,在轮纹病菌侵染过程中,MdMPK6的Western结果显示在其目标蛋白位置下总有一条显著的条带偏移,且乙烯抑制了这种偏移。MdMPK6与AtMKK7的Pull down试验结果表明乙烯抑制二者之间的互作。为了验证二者之间的互作与条带偏移的关系,本研究对MdMPK6蛋白的修饰进行了鉴定。分析结果表明乙烯的存在影响了该蛋白磷酸化位点的改变:轮纹病菌侵染使得236T位点发生磷酸化,乙烯的介入,使得发生磷酸化的位点从236 T变为231 T。生化数据表明236 T位点的磷酸化可能参与了 MdMPK6蛋白条带的偏移,231T位点的磷酸化阻止了 MdMPK6与AtMKK7的互作。具体的作用机制正在进一步的研究中。