论文部分内容阅读
氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyl-RNA synthetase，aaRS)催化氨基酸和对应tRNA之间的酯化反应，生成氨基酰-tRNA，参与蛋白质的生物合成。根据序列、结构和功能上的异同，20种aaRS可以分为Ⅰ和Ⅱ两大类。亮氨酰-tRNA合成酶(leuctl-tRNA synthetase，LeuRS)和精氨酰-tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase，ArgRS)属于Ⅰ类aaRS。 LeuRS专一地催化生成亮氨酰-tRNALeu(Leu-tRNALeu)。在一级结构上，LeuRS由编校结构域、催化结构域、反密码子结合结构域和C-末端结构域(C-terminal domain，CTD)等多个功能结构域组成。传统上，LeuRS可以分为两类，但根据CTD的不同，LeuRS可以进一步分为三类，包括细菌型，古菌型和真核型LeuRS。已有报道表明细菌型和古菌型LeuRS的CTD负责结合tRNA，而真核型LeuRS的CTD的功能尚未有研究报道。人类致病菌白色念菌株(Candida albicans，Ca)中，其LeuRS除了识别CatRNALeu外，还可以识别一种进化嵌合型的CatRNASer(CAG)，从而引起蛋白质翻译的紊乱。我们的研究发现CaLeuRS的CTD，特别是其中的3个赖氨酸残基，对识别CatRNASer(CAG)和CatRNASer均非常重要。进一步，通过酵母补偿实验，我们验证了这三个赖氨酸残基在体内的重要性。我们的研究首次证明真核型LeuRS的CTD对于识别tRNA也是至关重要的，并为以后治疗白色念菌株引发的疾病提供了理论依据。 根据可变茎环的长短，tRNA可以分为Ⅰ类和Ⅱ类。原核细胞和真核细胞质中只存在Ⅱ类亮氨酸tRNA(tRNALeu)，而真核细胞线粒体中只存在Ⅰ类tRNALeu。两种LeuRS分别催化这两类tRNALeu的亮氨酰化。但在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor,Sco)的细胞质中兼有两类tRNALeu对应一种LeuRS。ScotRNALeu(CAA)属于Ⅰ类tRNALeu，ScotRNALeu(UAA)属于Ⅱ类tRNALeu。本研究主要着重于ScoLeuRS和ScotRNALeu(UAA)的识别机制，发现ScotRNALeu(UAA)的C74代替A73成为新的辨别子。我们还发现ScoLeuRS的Arg525和Arg527可能负责识别ScotRNALeu的辨别子。这一研究为LeuRS和tRNALeu的共进化提供了证据。 除了对应的底物亮氨酸外，LeuRS可以误活化正缬氨酸(norvaline，Nva)，异亮氨酸(isoleucine，Ile)和缬氨酸(valine，Val)。为了保证翻译的正确进行，LeuRS进化出编校结构域(connective peptide1，CP1)负责水解误活化或误氨基酰化产物。一旦编校功能受损，会引起疾病。我们发现Nva是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LeuRS(ScLeuRS)编校功能最大的胁迫氨基酸，可以抑制ScLeuRS编校功能受损的酿酒酵母的生长;Nva可以误掺入蛋白质组，引起蛋白质误折叠，从而引起细胞中压力;细胞通过上调热休克蛋白质Hsp70帮助误折叠或未折叠蛋白质重折叠或降解。此外，我们还发现这种酵母细胞积累更多的脯氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺。这三种氨基酸可降低细胞中活性氧水平，从而激活下游一些列保护途径，保护细胞免受Nva的胁迫。这一研究有利于更好的了解细胞中应对编校缺陷压力的保护机制。 除了经典的蛋白质合成功能外，近年来，aaRS的非经典功能受到广泛关注。我们主要致力于研究精氨酰-tRNA合成酶(arginyl-tRNA synthetase，ArgRS)的非经典功能。哺乳动物细胞质中存在两种形式的ArgRS∶N端进化出72个氨基酸延伸(N72)的全长形式(FL-ArgRS)和短形式的单体形式(△NArgRS)。其中，FL-ArgRS是细胞质中多aaRS复合物(multi-synthetase complex，MSC)的一部分，其也可以入细胞核。而△NArgRS只定位在细胞质中游离分布。我们的研究结果表明N72对介导FL-ArgRS入核是必要但不充分的。此外，我们发现鼠源细胞中△NArgRS/ArgRS的比例远高于人源细胞。因此，我们致力于用CRISPR-Cas9技术敲掉NIH3T3细胞中的△NArgRS，以便研究△NArgRS的功能。