如何对基因组进行快速有效的测序是当今基因组科学面临的主要挑战之一。在成功完成人类基因组计划之后，生命科学界最重要的工作之一是获取所有个体的基因组序列，并依据获取的结果了解不同个体基因序列间的差异，分析不同个体对疾病的易感程度的差异，以及在药物反应上的差异。这是未来5-10年生命科学的核心研究之一。 成熟的DNA测序技术出现在上70年代中期，Maxam的化学降解法和Sanger的双脱氧链终止法几乎同时出现在1977年。进入20世纪80年代，四色荧光标记的测序引物法和荧光标记双脱氧核苷酸链终止法分别被商品化，标志着自动化测序时代的到来。经过近30年的发展，目前已有种类繁多的DNA测序技术，价格、认读长度、通量(速度)是判断一种测序方法优劣的标准。利用DNA微阵列高通量的特点，我们设计了基于DNA微阵列在片延伸技术的DNA测序新方法(中国专利申请号：200610096372．4)，开展了相关的研究工作，通过特定引物与待测靶序列杂交后进行在片延伸的方法，在延伸过程中用荧光标记的双脱氧核苷酸终止部分待测靶序列，通过检测微阵列荧光信号的方法获取序列信息，木论文的主要内容如下： 1．测序用DNA微阵列制备的优化： 分别制备醛基修饰玻片片基的DNA微阵列和琼脂糖膜涂覆玻片片基的DNA微阵列，比较在两种片基在片延伸的效率，结果表明，琼脂糖膜涂覆玻片片基具有较高的信号点荧光强度，但同时也具有较高的荧光背景。分别设计具有不同长度手臂分子的寡核苷酸探针，比较这些探针的延伸效率，结果表明，具有较长手臂分子长度的寡核苷酸探针具有较高的在片延伸效率。 2．在片延伸体系的优化： 现有的在片延伸体系是针对单碱基延伸(Single Base Extension，SBE)技术开发的，我们针对基于在片延伸DNA测序技术的需要，对现有的反应体系和方法进行了优化。比较了Tdq DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶和Klenow DNA聚合酶在延伸效率的差别，实验表明Therminator DNA聚合酶具有最佳的延伸效率和良好的保真性。比较了三种核苷酸体系用于在片延伸的差异，结果表明逐次加入具有相同核苷两种核苷酸(荧光标记的双脱氧核苷酸和普通脱氧核苷酸)的混合物作为延伸反应的核苷酸体系，可以满足在片多碱基延伸测序的要求。比较了荧光标记的双脱氧核苷酸和普通脱氧核苷酸的浓度比例对在片延伸信号的影响，实验表明当固定荧光标记的双脱氧核苷酸的浓度不变，随着普通脱氧核苷酸浓度的不断增高，荧光信号强度随之不断下降。 3．基于在片延伸的DNA测序技术研究： 在前两项研究的基础上，运用在片延伸技术进行DNA序列的测定。在单步多碱基测序实验中，运用在片延伸的方法，准确地测定了寡核苷酸探针最长4个碱基的序列信息，验证了基于在片延伸DNA测序技术的可行性。在多步多碱基测序实验中，运用在片延伸的方法，准确地测定了寡核苷酸探针最长10个碱基的序列信息。町以相信，对在片延伸技术的一些改进可以延长该方法的认读长度，最终使基于在片延伸的DNA测序技术成为一项在价格、认读长度和通量上都具有优势的测序技术。 4．荧光信号的淬灭方法的探索： 对DNA微阵列上荧光信号的淬灭有助于延长本测序方法认读长度，为此我们针对荧光的淬灭做了一些探索性研究。我们采用过硫酸氨作为淬灭剂，实验证明，过硫酸氨对Cy3，Cy5，Tamra三种荧光分子均有较好的淬灭作用，但同时对DNA也有一定的损伤。