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第一部分中国人群先天性巨结肠症RET,NRG1,NRG3基因 SNPs位点关联研究及交互作用分析研究目的:本课题对文献报道中GWAS发现的RET基因上的两个SNPs位点,NRG1和MRG3上各三个SNPs位点与中国人群HSCR发病风险进行关联分析。探究这八个位点阳性SNPs所在的基因与基因的联合效应对HSCR易感性的影响程度。通过以上三个主要候选基因SNPs与HSCR的相关性研究,为进一步阐明中国人群HSCR发病的分子学机制提供了实验依据。材料与方法:1.实验标本采集和全血基因组DNA抽提:根据国际公认的巨结肠诊断标准（2005年第四届国际巨结肠与相关神经嵴源性疾病会议）,诊断依据术中组织活检或者术后病理检查确诊为HSCR的患者为病例组。对照组血液标本选择于同一时期无消化道和神经嵴相关畸形的患者。本研究经华中科技大学同济医学院伦理委员会批准,全部患儿及对照组留取的组织及血液标本均获得家长知情同意。基因组DNA抽提采用德国Qiangen公司试剂盒提供的方法抽提,提取后-80℃低温冰箱保存备用。2.SNP的确定和分型:利用出版文献和生物信息学数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）查找目的基因的多态性位点。本研究采用以医院为基础的病例-对照研究,选取RET基因两个多态性位点,NRG1和NRG3基因多态性位点各三个,采用PCR扩增目的基因,Taqman基因分型技术对上述八个位点进行基因型检测。3.RET、NRG1和NRG3基因和HSCR相关性的统计学分析:本研究将对上述八个位点与HSCR发病风险的关系,以及RET、NRG1和NRG3基因各位点之间联合作用对HSCR发病影响采用非条件Logistic回归（Logistic regression,LR）的方法进行统计分析。SNPs位点与HSCR的相关性用ORs（比值比,odds ratios,）和95%CIs（可信区间,confidence intervals,）表示。病例组和对照组人口学资料中的分类变量（如性别等）和连续变量（如年龄等）之间的差异分别采用卡方（Chi squared,X2）检验和t检验进行比较。采用Logistic回归模型分析不同基因的多个SNPs联合作用以及不同位点基因的累积效应与HSCR发病风险的关系。同一基因上不同SNPs位点之间的连锁不平衡程度应用Haploview4.2软件进行分析。运用Hardy-weinberg平衡定律来检验两组样本人群中各SNPs位点基因频率与基因型频率是否平衡。所有数据P值＜0.05确定为具有统计学差异。实验结果:1.本次研究共纳入362例HSCR病例和1442例对照。在两组中男女所占百分比均为75.97%和24.03%,病例组和对照组中年龄平均值分别为1.01（±0.88）岁和1.18（±0.79）岁。性别和年龄分布情况在病例组及对照组中比较无统计学差异（P＞0.05）。2.在此次病例-对照研究的八个GWAS发现位点中,位于RET基因转录增强子区的两个SNP位点rs2435357和rs2506030以及位于NRG1基因一号内含子区的两个SNP位点rs2439302和rs7835688均与HSCR发病风险相关（P＜0.05）。但是,位于NRG1一号内含子区的位点rs16879552以及NRG3基因一号内含子区的三个SNP位点rsl0748842,rs10883866和rs6584400均与HSCR发病风险无相关性（P＞0.05）。除此之外,在纯和和杂合突变中也未发现HSCR与其相关性。3.对病例组和对照组连锁不平衡分析显示:RET基因中rs2435357和rs2506030两位点间连锁不平衡r2=0.041,说明两位点间连锁不平衡程度较弱;NRG1基因中rs2439302和rs7835688两位点间连锁不平衡r2=0.95,说明两位点间连锁不平衡程度较强。所以在后续实验中,我们用rs2439302多态性位点代表rs7835688多态性位点对基因-基因之间的累积效应进行分析。通过软件分析,在HSCR和对照组儿童中各SNP位点基因频率与基因型频率均符合Hardy-weinberg平衡。4.对上述四个位点的累积效应分析发现rs2506030-GG和rs2439302-GG以及rs2435357TT和rs2439302-GG突变纯和位点同时存在时,个体患HSCR风险分别增加 25.69 倍（95%CI=10.11-65.29,P=9.12E-12）和 25.57 倍（95%CI=10.88-60.07,P=1.02E-13）;当 rs2506030-GG,rs2439302-GG 和 rs2435357-TT 三个突变纯和位点位点同时存在时,个体患HSCR风险增加56.63倍（95%CI=12.16-262.83,P=4.50E-07）。同时,在携带有 rs7835688-CC 和 rs2506030-GG,以及 rs7835688-CC和 rs2435357-TT 或者 rs7835688-CC,rs2506030-GG 和 rs2435357-TT 纯和个体中,患有 HSCR 风险分别为 OR=24.13（95%CI=9.54-61.05,P=1.80E-11）,OR=24.10（95%CI=9.82-59.13,P=3.68E-12）,OR=54.83（95%CI=10.94-274.74,P=1.12E-06）。同时,我们检测了上述三个SNPs位点的风险等位基因累及基因效应与疾病风险的关系。携带有四个以上等位基因位点的个体患HSCR的风险较高（携带有4、5、6个等位基因的患病风险分别为OR=2.30,P=5.54E-11;OR=4.28,P=2.08E-18;OR=23.43,P=5.11E-13）。而携带有小于4个等位基因则表现出保护效应（携带有0、1、2、3个等位基因的患病风险分别为OR=0.39,P=5.09E-02;OR=0.27,P=3.16E-04;OR=0.33,P=4.32E-10;OR=0.59,P=8.00E-05）。最高患病风险是最低患病风险的86.8倍。实验结论:1.RET和NRG1基因是中国HSCR患儿的易感基因;2.在中国人群中首次证实GWAS中发现的位点rs2439302与HSCR的发病风险相关;同时在中国人群中验证了 rs2435357,rs2506030,和rs7835688与HSCR的发病风险相关;3.HSCR易感基因RET及NRG1上的SNPs互相连锁。患HSCR的风险随着个体风险等位基因的增加而不断升高,呈现出等位基因-剂量（风险等位基因个数）效应;4.rs2506030,rs2439302,rs2435357 和 rs7835688 在 HSCR 的遗传易感性中发挥着重要的基因-基因交互作用,但其生物学机制需要进一步研究。第二部分RET,基因单核苷酸多态性对基因表达的影响研究目的:分析RET基因功能性多态性位点rs2506030和rs2439302,NRG1基因功能性多态性位点rs2435357和rs7835688对基因表达的影响。材料与方法:1.在第一部分中,由于rs2439302和rs7835688存在连锁不平衡（r2=0.95）,所以在此部分我们用rs2439302多态性位点功能代表rs7835688多态性位点功能。在病理结果证实的HSCR病人中各选取十例rs2506030,rs2439302和rs2435357野生型,杂合突变型以及纯和突变型位点具有神经节细胞部分的全层结肠组织。提取组织蛋白及总RNA。运用real-time PCR和western blot方法检测组织中RET基因和NRG1基因的mRNA转录和蛋白质表达水平。2.免疫组化:分别选取相应患儿扩张段肠管组织切片,观察肠管中神经元,确定含有神经元石蜡块,分别行RET及NRG1免疫组化染色,观察肠管组织切片镜下上述两种基因表达水平。实验结果:与rs2435357-CC或rs2506030-AA相比,RET基因mRNA,蛋白表达水平以及免疫组化染色显示在rs2435357-CT和rs2435357-TT或者rs2506030-AG和rs2506030-GG显著降低;在rs2439302位点,具有G风险等位基因的纯合个体中,NRG1基因mRNA,蛋白表达水平以及免疫组化染色显著低于具有CC基因型的纯合个体。实验结论:RET 基因 rs2506030,rs2439302 和 NRG1 基因 rs7835688 和 rs2435357 单核苷酸多态性与RET,ARG1基因的活性密切相关,能影响其所在基因mRNA转录及蛋白在结肠肠管的表达水平。