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胃癌是源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤,是最常见的消化道恶性肿瘤之一,临床预后差,病死率高。进一步深入研究促进胃癌发生发展的分子生物学机制,对寻找更加有效的胃癌治疗策略有重要意义。本实验以人胃癌组织标本、胃癌细胞系和裸鼠成瘤模型为研究对象,目的研究miR-224在胃癌中的表达、对胃癌细胞生物学行为的影响以及相关的分子机制。本实验共分3部分:1.miR-224在胃癌组织及胃癌细胞系中的表达及临床意义Micro RNA(miRNA)是一类内源性非编码小RNA分子,在真核生物基因表达调控中起到非常重要的作用。研究显示,胃癌组织中一些miRNA表达异常,参与胃癌生长和转移等病理学进程。本研究收集了2010年1月至2012年12月胃癌手术患者切除的胃癌组织和癌旁组织,经Deep sequencing检测两者中差异表达的miRNA。结果显示,与癌旁组织相比,胃癌组织中有30种miRNA(如miR-188、miR-490等)表达下调,32种miRNA(如miR-224、miR-212等)表达上调。其中,胃癌组织中miR-224表达水平升高最为显著。QRT-PCR结果同样证实胃癌组织中miR-224的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.01)。进一步检测发现,5种胃癌细胞系(HS-746T、MKN-45、HGC-27、SNU-5和BGC-823)中miR-224的表达水平明显高于正常细胞系细胞(GES-1)(P<0.001)。为明确miR-224表达异常的临床意义,我们对患者临床资料进一步分析,结果显示胃癌组织中miR-224表达与胃癌患者肿瘤大小和淋巴结转移呈正相关(P<0.05),并且miR-224高表达胃癌患者生存期较miR-224低表达患者生存期明显缩短。本结果提示miR-224在胃癌组织中的表达高于癌旁组织,可作为胃癌病情进展的生物学标志物,其表达增高提示胃癌预后不良。2.miR-224促进胃癌细胞的增殖抑制胃癌细胞凋亡第一部分研究结果表明,miR-224在胃癌中高表达并提示预后不良,但miR-224对胃癌细胞生物学行为的影响尚无明确报道。因此,本部分研究进一步探讨miR-224在胃癌细胞(HS-746T和BGC-823)增殖、转移和抗凋亡中的作用。通过CCK8检测miR-224对胃癌细胞增殖活性的影响,结果显示,与对照组相比用miR-224 inhibitor处理的胃癌细胞增殖能力减弱(p<0.05),而转染miR-224(miR-224 mimics)的胃癌细胞增殖能力增强(p<0.05)。流式细胞术检测细胞周期发现,转染miR-224抑制剂(miR-224 inhibitors)可使处于G1期的胃癌细胞比重增多,S期细胞减少(p<0.05),并且诱导胃癌细胞凋亡增加(p<0.01)。并且,通过Western blot和QRT-PCR检测发现,在miR-224 inhibitor处理的胃癌细胞中周期相关蛋白PCNA、Cyclin-D1和Cyclin-D2表达下调,细胞周期抑制蛋白P21和P27表达上调(P<0.05)。免疫荧光检测同样显示,转染miR-224 inhibitor可减弱胃癌细胞中Cyclin-D1和CDK4的表达。将未处理和转染miR-224的HS-746T细胞分别接种至裸鼠皮下构建裸鼠荷瘤模型,可观察到与对照组相比接种miR-224低表达胃癌细胞的裸鼠肿瘤生长速度变慢(p<0.001),平均重量体积更小(p<0.001)。本部分研究结果表明,miR-224可促进胃癌细胞的增殖和抗凋亡能力,并促进在体胃癌组织的生长,抑制miR-224表达可作为胃癌治疗的潜在手段。3.miR-224通过靶向m TOR促进胃癌的增殖转移能力以及抗凋亡能力为解释miR-224促肿瘤分子机制,我们通过生物信息学方法搜索miR-224的潜在作用靶点,发现细胞凋亡和增殖的关键调控蛋白m TOR的3’UTR端有miR-224的结合位点。荧光素酶报告实验证实,miR-224可与该位点结合后调控荧光素酶的表达。通过Western blot和QRT-PCR检测发现,转染miR-224 mimics的胃癌细胞(HS-746T和BGC-823)中m TOR m RNA和蛋白表达增加(p<0.05),而用miR-224 inhibitors处理后的胃癌细胞中m TOR表达减少(p<0.05)。Transwell实验和细胞集落实验结果显示,miR-224可促进胃癌细胞迁移、侵袭和体外成集落,miR-224 inhibitor处理或敲除m TOR可使胃癌细胞的迁移、侵袭与集落形成能力明显减弱。通过Western blot和QRT-PCR检测m TOR相关的凋亡信号发现,miR-224 inhibitor可使m TOR和Bcl2表达减弱,而Bax和Caspase 3/9的表达增强。免疫荧光染色结果也显示,miR-224和miR-224 inhibitor分别上调和下调m TOR和Caspase 3在胃癌细胞中的表达。对荷瘤裸鼠的肿瘤组织进行免疫组化染色可知,miR-224 inhibitor可使肿瘤组织Tunel染色阳性细胞增多,Ki67阳性细胞数减少。Western blot结果提示,转染miR-224 inhibitor可下调肿瘤组织中m TOR、Bcl2、PCNA、Cyclin-D1和Cyclin-D2的表达,上调Bax、Caspase 3/9、P21和P27的表达。以上结果表明m TOR是miR-224的直接作用靶点,miR-224通过调控m TOR促进抗凋亡和促细胞增殖的蛋白表达增加,并抑制促凋亡蛋白的表达下调,从而促进胃癌的生长、转移和抗凋亡能力。miR-224/m TOR信号轴可作为新型药物的作用靶点,有望为胃癌临床精准化治疗提供一条新途径。