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目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性关节滑膜炎症及血管翳形成为主要病理特征的系统性自身免疫病。RA的发病机制尚不十分清楚,有研究报道钙网织蛋白(Calreticulin,CRT)可能参与了RA滑膜炎症的形成。本课题在前期研究基础上,采用ELISA及免疫荧光的方法检测了CRT及黏附分子在RA患者血清、滑液以及滑膜中的表达,并分析血清、滑液中CRT与黏附分子含量的相关性;然后利用脐静脉内皮细胞体外培养模型分析了CRT对黏附分子表达的调节作用及其分子机制。通过研究CRT调节细胞黏附作用进而参与滑膜炎症形成,从新的角度探讨RA的病理机制,为RA的临床诊断和治疗奠定实验基础。方法1.本研究所选取的患者标本均来自2013年2月至2014年2月天津医科大学总医院风湿免疫科和天津医院关节外科中心,其中血清标本包括RA患者60例,女47例,男13例,年龄55~79岁。关节滑膜和滑液标本:RA:10例,其中女7例,男3例,年龄52~62岁;OA:14例,其中女10例,男4例,年龄56~69岁。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA血清和滑液中CRT及黏附分子的含量。2.采用免疫组织荧光方法分析CRT和黏附分子在RA及OA滑膜中的定位。3.分离培养原代脐静脉内皮细胞,分析CRT对ICAM-1表达的影响。4.免疫印迹(Western blot)检测CRT对Akt及eNOS活化的影响,并分析PI3K及e NOS抑制剂作用后ICAM-1的表达。统计学分析采用SPSS17.0软件。计量资料以sx±表示,两组间比较采用Student-Newman-Kenls检验进行统计分析。检验水准为双侧a=0.05。结果1.可溶性CRT在RA患者血清及滑液中表达量为(5.359±2.27)ng/ml,(4.997±0.826)ng/ml;可溶性ICAM-1以及VCAM-1在血清中的含量分别为(485.772±197.612)ng/ml,(419.609±188.338)ng/ml;在关节液中为(579.467±70.604)ng/ml和(511.368±101.39)ng/ml。分别分析RA患者血清和滑液中CRT与 s ICAM-1以及CRT与s VCAM-1含量的相关性。结果显示,血清中CRT与s ICAM-1及与s VCAM-1均呈正相关(R2分别为0.612,0.554)差异具有统计学意义。关节液中CRT与s ICAM-1及与s VCAM-1也呈正相关(R2分别为0.710,0.405),差异具有统计学意义。2.免疫组织荧光结果显示,与OA组相比,CRT及黏附分子ICAM-1,VCAM-1在RA滑膜组织的表达均增高;其中CRT在RA的滑膜衬里层和衬里下层,血管内皮细胞及血管周围均有较强的表达,而在OA的衬里层和血管周围有较弱的表达。结果显示,CRT在两组患者滑膜组织中的表达量和定位均存在显著的差异。ICAM-1与CRT共同表达在RA滑膜组织的血管内皮细胞上,VCAM-1则主要定位在RA滑膜衬里层细胞。3.CRT作用于内皮细胞使黏附分子的表达上调,且具有剂量依赖性。当CRT浓度为5ng/ml时,与空白对照组无统计学差异(平均荧光强度MFI:(98.7±10.51)),当浓度达到50n/ml及更高时ICAM-1的表达显著升高。4.CRT能够促使内皮细胞Akt的磷酸化,激活PI3K/Akt通路。PI3K/Akt被抑制时,CRT活化的e NOS减少。PI3K/Akt-e NOS通路被抑制剂后CRT诱导的ICAM-1的表达也明显下调。结论1.CRT及可溶性黏附分子s ICAM-1、s VCAM-1在RA患者血清及滑液中的表达量均升高,且CRT与这两种黏附分子在血清和关节液中的含量均呈正相关。2.CRT与ICAM-1共同表达在RA滑膜血管内皮细胞及血管周围;与VCAM-1则共定位于RA滑膜衬里层细胞。3.CRT能够上调内皮细胞ICAM-1的表达,且具有剂量依赖性。4.CRT可通过活化内皮细胞中的Akt蛋白,从而调节ICAM-1的表达。另外eNOS作为PI3K/Akt的下游分子也参与了CRT对黏附分子的调节。本课题研究结果提示CRT可通过PI3K/Akt/e NOS这条信号通路调节黏附分子的表达进而促进RA滑膜炎症反应,参与RA病理机制的形成。